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目的:依据慢传输型便秘(Slow transit constipation,STC)患者的临床症状、影像学检查及手术中验证所见可分为结肠痉挛的STC患者和结肠非痉挛的STC患者。本实验通过利用肠神经系统(Enteric nervous system,ENS)特异性标志物5-HT4与5-HT7来对STC患者乙状结肠肠壁组织进行免疫组织化学染色检查,与正常对照组对比,查看STC患者肠壁组织的异常改变,探讨便秘的产生机制,为STC患者的治疗寻找新的药物靶点。方法:1标本采集1.1标本的选择:术前通过2次结肠传输试验,每次72小时,证明结肠传输缓慢,结肠内残留标记物超过总标记物的20%,排除结肠的器质性病变及别的全身疾病,诊断标准切合罗马III关于STC的描写。汇集经钡灌肠和手术证实都有结肠痉挛的STC患者10例,取其乙状结肠痉挛段肠壁组织作为STC痉挛组标本;汇集钡灌肠和手术时都未证实有结肠痉挛的STC患者10例,取其乙状结肠肠壁组织作为STC非痉挛组标本;汇集以往既无乙状结肠器质性病变,又无慢性便秘病史及其它全身系统系疾病的直肠癌或降结肠癌患者乙状结肠段10例作为正常参照组,其标本取自距肿瘤边沿5cm以上的正常肠壁组织。1.2标本采集方法:术中切除局部肠管标本后切取其全层肠壁组织,大小为2cm×2cm,务必除去钳夹部位的肠壁组织,STC痉挛组切取乙状结肠痉挛段的肠壁组织作为标本,STC非痉挛组切取乙状结肠某一部分肠壁组织作为标本,正常参照组切取距肿瘤边沿5cm以上的正常乙状结肠肠壁组织作为标本。1.3标本处理:组织标本切取后,利用PBS缓冲液冲刷后放入4%多聚甲醛溶液中固定,待24h取出后开始修剪标本,经梯度乙醇脱水,二甲苯透明,浸蜡,包埋制成石蜡标本。2染色镜检2.1石蜡标本切片制备:使用切片机切片,温水漂浮法展片,捞片,烤干备用。2.2染色:切片经脱蜡、水化、抗原修复、3%甲醇双氧水孵育、血清封闭后滴加一抗(5-ht4、5-ht7)及二抗,尔后经dab显色、苏木素复染、梯度乙醇脱水等过程,最后封片。2.3镜检:在生物显微镜下,察看5-ht4与5-ht7在乙状结肠粘膜层和肌层的染色,应用计算机图像分析系统进行定量分析,使用image-proplus6.0专业图像分析软件进行定量分析。每张切片随机选取3个待测视野,测定阳性区域面积和阳性比率,计算光密度值,计算每个视野的阳性染色指数(阳性比率×光密度值×l00),最后计算平均值。2.4采图:应用吸管器材选择阳性区域,选取确定后将目标颜色文件保存,同一批次图片采纳相同的目标颜色文件进行处理。3数据统计分析:使用统计学软件spss20.0对数据进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差((?)±s)或中位数(p25,p75)表示,各组数据比较采用t检验或秩和检验,p<0.05为差别有统计学意义。结果:1 5-ht4受体免疫组化染色:正常对照组乙状结肠中5-ht4受体阳性染色在结肠黏膜层、肌层,尤其是肌间神经丛均有散布,在肌细胞上有少量表达。在黏膜层,阳性染色主要散布于局部腔面杯状细胞膜和吸收性上皮细胞。1.1痉挛组与非痉挛组比较:5-ht4受体在痉挛组stc病人的乙状结肠黏膜层的表达无明显统计学意义(p>0.05),5-ht4受体在痉挛组stc病人的乙状结肠肌间神经丛的表达降低,有明显统计学意义(p<0.05)。1.2实验组与正常对照组比较:无论黏膜层还是肌间神经丛5-ht4受体在痉挛和非痉挛两组stc病人的乙状结肠表达都降低(P<0.05),差别有统计学意义。2 5-HT7受体免疫组化染色:正常对照组乙状结肠中5-HT7受体阳性染色在黏膜层和肌层均有散布,其中以肌间神经丛为主。2.1非痉挛组与正常对照组比较:无论黏膜层还是肌层5-HT7受体在非痉挛组STC病人的乙状结肠表达都增高(P<0.05),差别有统计学意义。2.2痉挛组与正常对照组比较:无论黏膜层还是肌层5-HT7受体在痉挛组STC病人的乙状结肠表达无明显统计学意义(P>0.05)。2.3非痉挛组与痉挛组作比较:无论黏膜层还是肌层5-HT7受体在非痉挛组STC病人的乙状结肠表达都增高(P<0.05),差别有统计学意义。结论:1乙状结肠痉挛和非痉挛的STC患者的黏膜层和肌间神经丛中的5-HT4受体的表达均较正常对照组降低,推测5-HT4受体激动剂可以改善结肠动力。2与乙状结肠非痉挛的STC患者相比,5-HT4受体在乙状结肠痉挛的STC患者的肠黏膜层表达无明显统计学意义,而在肌间神经丛表达显著降低。这可能是由于痉挛的乙状结肠其结肠肌间神经丛病变导致的。3 5-HT4受体在乙状结肠痉挛患者中表达的下降可能参与了单纯结肠痉挛发生的病理生理基础。4乙状结肠非痉挛的STC患者的黏膜层和肌层的5-HT7受体表达均较正常对照组增高,5-HT7受体的高表达可能导致结肠平滑肌松弛,从而抑制了肠蠕动及分泌反射的正常进行。5乙状结肠非痉挛STC患者的黏膜层和肌层的5-HT7受体的表达高于乙状结肠痉挛的STC患者。这可能是因为乙状结肠痉挛的STC患者其乙状结肠肠壁神经系统受到损害所致。