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第一部分miR-1296-5p在胃癌组织细胞中的表达及其与临床病理特征的关系目的:我国胃癌的发病率及死亡率居高不下,严重威胁着我国国民的生命健康。为此,研究胃癌明确诊断的生物标志物和有效治疗的靶点成为亟待解决的热点。miRNA在胃癌发生发展中表达失调,其表达变化与胃癌的恶性度及预后相关。miR-1296-5p在多种肿瘤表达异常,在消化系统不同部位肿瘤之间的表达模式不同。本研究旨在明确miR-1296-5p在胃癌组织细胞中的表达变化,及其与胃癌患者临床病理特征之间的关系。方法:收集胃癌患者手术切除的胃癌及配对癌旁组织标本,同时培养胃癌细胞系及正常胃粘膜上皮细胞,用Real-time PCR方法检测miR-1296-5p在胃癌组织及细胞中的表达变化。收集患者临床资料,分析miR-1296-5p表达变化与患者临床病理学特征之间的关系。结果:miR-1296-5p在胃癌组织中的表达显著低于其配对的癌旁组织（P<0.01）;与正常胃上皮细胞GES-1相比,miR-1296-5p在胃癌细胞系BGC-823、NCI-N87、MGC-803、MKN-28、AGS、SGC-7901中的表达均显著降低（P=0.037,P=0.033,P=0.035,P=0.023,P=0.006,P=0.005）。miR-1296-5p表达水平与胃癌的浸润深度（P=0.007）及TNM分期（P=0.003）呈显著负相关。小结:miR-1296-5p在胃癌组织及细胞中表达下调,miR-1296-5p的低表达与胃癌的浸润深度及TNM分期相关,miR-1296-5p可能参与了胃癌的发生。第二部分miR-1296-5p对胃癌细胞生物学行为的影响目的:miR-1296-5p在多种肿瘤中表达异常,在不同种类肿瘤中发挥不同甚至相反的作用,或发挥促癌作用,或发挥抑癌作用。本研究主要探讨miR-1296-5p对胃癌细胞生物学行为的影响。方法:通过在胃癌细胞系SGC-7901和MGC-803中转染miR-1296-5p-mimics或miR-1296-5p-inhibitors使其分别过表达或抑制其表达,用Real-time PCR法验证过表达及抑制效果。用流式细胞术检测细胞周期分布,用MTT法检测细胞增殖活力,用划痕愈合实验及Transwell迁移及侵袭实验检测细胞的迁移及侵袭能力。明确miR-1296-5p对胃癌细胞生物学行为的影响。结果:转染miR-1296-5p-mimics后,SGC-7901和MGC-803细胞系中处于S期的细胞所占百分比（P=0.009,P<0.001）及细胞增殖活力（P=0.012,P=0.032）显著低于转染NC-mimics的细胞;相反,转染miR-1296-5p-inhibitors抑制其表达后,处于S期的细胞所占百分比（P=0.001,P=0.026）及细胞增殖活力（P=0.002,P=0.006）显著高于转染NC-inhibitors的细胞。转染miR-1296-5p-mimics的SGC-7901和MGC-803细胞的划痕愈合率（P=0.0455,P<0.001）及Transwell迁移（P=0.005,P=0.005）及侵袭细胞数（P=0.002,P=0.047）,显著低于转染NC-mimics的细胞;相反,转染miR-1296-5p-inhibitors后,与转染NC-inhibitors的对照组相比,细胞的划痕愈合率（P=0.002,P=0.036）及Transwell迁移（P=0.003,P=0.004）及侵袭细胞数（P=0.002,P<0.001）显著升高。小结:miR-1296-5p表达增高可抑制胃癌细胞增殖、迁移及侵袭能力,miR-1296-5p可能在胃癌细胞中发挥抑癌作用。第三部分miR-1296-5p在胃癌细胞中作用靶点的筛选及验证目的:上一部分结果表明,miR-1296-5p可抑制胃癌的增殖、迁移及侵袭能力,但其作用机制尚不清楚。目前观点认为,miRNA通常通过与靶基因mRNA的3’UTR结合,抑制靶基因的翻译。本研究筛选miR-1296-5p靶基因并进行验证,阐明其作用机制。方法:在胃癌细胞系SGC-7901和MGC-803中转染miR-1296-5p-mimics或miR-1296-5p-inhibitors过表达及敲低miR-1296-5p。用Targetscan软件（targetscan.test/ucsc.html）、miRBase软件（http://www.mirbase.org）和PicTar软件（http://pictar.mdc-berlin.de）预测miR-1296-5p靶基因,从中筛选出表达受到miR-1296-5p负性调控的蛋白,并用Real-time PCR及Western blot方法进行验证。在40对胃癌患者的肿瘤及癌旁标本中验证miR-1296-5p和靶基因表达的相关性。构建含有靶基因mRNA的3’UTR区荧光报告质粒,用荧光素酶活性分析,证实miR-1296-5p与靶基因mRNA的3’UTR区的结合。用补救实验,在过表达miR-1296-5p的胃癌细胞中,转染靶基因过表达质粒,检测胃癌细胞的增殖和侵袭能力,明确miR-1296-5p通过靶基因发挥的抑癌作用。结果:在胃癌细胞系SGC-7901及MGC-803中转染miR-1296-5p-mimics,CDK6及EGFR mRNA（CDK6,P=0.001,P=0.001;EGFR,P=0.002,P=0.012）及蛋白水平（CDK6,P=0.040,P=0.048,EGFR,P=0.002,P=0.008）均显著降低,反之,转染miR-1296-5p-inhibitors后,两种蛋白的表达水平显著升高（CDK6,P<0.001,P<0.001;EGFR,P<0.001,P=0.002）,而NCL的表达水平无显著变化,表明在胃癌细胞中CDK6和EGFR可能是miR-1296-5p的靶基因。CDK6及EGFR在胃癌组织中的表达水平显著高于其配对的癌旁组织,并且CDK6及EGFR在胃癌组织的表达水平与miR-1296-5p表达水平呈负相关（P<0.001,r=0.859;P=0.010,r=0.507）。荧光素酶活性分析结果显示,转染miR-1296-5p-mimics后,与转染NC-mimics组比,SGC-7901及MGC-803细胞中psiCHECK-2/CDK6-3’-UTRwt（P=0.004,P=0.038）和psiCHECK-2/EGFR-3’-UTRwt（P=0.027,P=0.006）产生的荧光被显著抑制,但并不影响两种细胞psiCHECK-2/CDK6-3’-UTRmut（P=0.204,P=0.173）和psiCHECK-2/EGFR-3’-UTRmut（P=0.362,P=0.486）的荧光,表明预测位点为miR-1296-5p结合位点。在SGC-7901和MGC-803细胞中转染miR-1296-5p-mimics后,细胞增殖及侵袭能力显著降低,转染CDK6或EGFR过表达质粒后,细胞增殖活力（CDK6,P=0.002,P=0.004;EGFR,P=0.032,P=0.026）及侵袭细胞数（CDK6,P=0.022,P=0.037;EGFR,P=0.003,P<0.001）目显著回升。小结:miR-1296-5p通过结合靶基因CDK6和EGFR mRNA的3’UTR区,抑制其表达,在胃癌组织细胞中发挥其抑癌作用。结论:miR-1296-5p在胃癌组织及细胞中表达下调,其低表达与胃癌的浸润深度及TNM分期相关;miR-1296-5p通过结合于其靶基因CDK6和EGFR mRNA 3’UTR区,抑制其表达,从而抑制胃癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力。