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目的:2005年以来,新型鸭呼肠孤病毒病开始在中国养鸭业发生、流行,且发展趋势越来越严峻,给养鸭业带来较大的经济损失。天然免疫是机体抵抗病原微生物感染的第一道防线,因此开展新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)调控的宿主天然免疫应答机制的研究,能对预防和控制该病提供新思路和方法。本研究在NDRV感染宿主细胞后，对诱导产生的干扰素IFN-β、IFN-λ进行克隆和表达,并测定了 NDRV染毒细胞干扰素信号通路相关基因的mRNA表达水平,为研究NDRV调控宿主天然免疫的机理研究奠定了基础。方法:实验一:NDRV感染半番鸭胚成纤维细胞,收集不同时间点的染毒细胞,进行RNA总提取及反转录,采用实时荧光定量PCR,检测天然免疫相关细胞因子的mRNA表达水平。实验二:根据GenBank上发布的麻鸭IFN-β(KM035791)及IFN-λ(KJ 206897)编码框的全基因序列,各设计引物,采用PCR法,从半番鸭成纤维细胞中扩增得到半番鸭IFN-β及IFN-λ基因。目的基因和载体pET-30a经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后,构建重组表达质粒,转化至大肠杆菌DH5α。挑取阳性质粒,经PCR、双酶切和测序鉴定,确定重组质粒表达载体构建成功。实验三:将构建成功的半番鸭源IFN-β重组表达质粒pET-DuIFN-β转化至感受态细胞BL21(DE3),挑选单个菌落接种于卡那霉素抗性的液体LB,并加入IPTG诱导表达,收集菌液在冰上超声破碎细菌,取上清和沉淀进行SDS-PAGE及 Western blot 分析。结果:实验一:NDRV感染半番鸭胚成纤维细胞后,干扰素IFN-α、IFN-β和IFN-γ随接毒时间的延长表达量不断升高,48 h到达分泌高峰,随后下降;模式识别受体MDA5、RIGI和TLR7,抗病毒蛋白ISG12和IFITM3也表现出相似的表达规律,但是抗病毒蛋白Mxl却没有下降的趋势。实验二:结果表明,半番鸭IFN-β基因与IFN-γ基因序列具有完整的编码阅读框,大小分别为729 bp和558 bp,可编码氨基酸242个和185个。核苷酸同源性比较表明,半番鸭IFN-β基因与各品种鸭的IFN-α基因的同源性在87.2%～89.4%之间,与鸭IFN-β基因的同源性为100.0%,与鹅IFN-β基因的同源性为90.8%,与鸡IFN-β基因的同源性为70.0%;半番鸭IFN-λ基因与各品种鸡IFN-γ基因的同源性在75.8%～76.0%之间;与鸭IFN-γ基因的同源性为97.1%。遗传进化分析表明,半番鸭IFN-β基因与鸭源IFN-β基因属同一进化分支,与鸡源IFN-β基因呈独立分支;半番鸭IFN-λ基因与鸭IFN-γ呈同一进化分支,与鸡源IFN-λ在遗传关系上呈独立分支;种属关系越近,核苷酸序列的同源性越高。实验三:IFN-β的原核表达。SDS-PAGE分析表明,蛋白在菌体沉淀中表达明显,而在菌体上清中不明显,表达产物以包涵体的形式存在。Westernblot分析表明,融合蛋白在38 kDa处有一条非常明显的蛋白印迹,His标签蛋白在大约12kDa处有一条清晰的蛋白印迹,可见融合蛋白IFN-β表达成功。结论:1.NDRV感染半番鸭胚成纤维细胞后,激活了宿主细胞干扰素通路的天然免疫反应。为深入研究NDRV入侵与宿主天然免疫防御的相互作用研究奠定基础。2.成功克隆了半番鸭IFN-β基因与IFN-λ基因,为病毒调控半番鸭天然免疫研究奠定基础。3.在pET-30a中原核表达了半番鸭IFN-β蛋白成功,为IFN-β的生物活性及抗病毒制剂的研制奠定基础。