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第一部分 MIIP在鼻咽癌中的表达及临床意义目的:检测MIIP在鼻咽癌组织中的表达情况,分析MIIP与临床病理因素及预后的关系。方法:1.采用免疫组化法检测96例鼻咽癌石蜡标本组织中MIIP表达情况,并分析其与临床病理因素的关系。2.采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,比较MIIP阴性表达组及阳性表达组3年无进展生存率的差异。3.风险比例模型(Cox回归)分析影响预后的不良因素。结果:1.96例鼻咽癌标本中29例MIIP表达阳性(阳性率:30.21%)。MIIP基因的表达与患者T分期、N分期、TNM分期、3年内复发、转移因素相关(p<0.05)。2.96例患者的3年无进展生存率为79.8%(95%CI:0.708-0.863),MIIP蛋白阳性表达组及阴性表达组3年无进展生存率分别为89.7%(95%CI:0.816-0.947)及70.1%(95%CI:0.515-0.765),差异有统计学意义(p<0.05)。3.单因素分析得出T分期、N分期,TNM分期及MIIP阴性表达为预后不良因素。多因素分析得到 N 分期(HR:8.892,95%CI:3.561-14.033,p=0.014)、TNM 分期(HR:4.065,95%CI:1.878-6.239,p=0.034),MIIP(HR:3.583,95%CI:2.185-4.077,p=0.043)为影响鼻咽癌患者生存的独立不良预后因素。结论:MIIP基因与鼻咽癌的发生发展相关,其有可能用于鼻咽癌的预后监测,作为鼻咽癌治疗的靶分子。第二部分 MIIP表达对鼻咽癌细胞恶性生物学行为的影响目的:体外实验初步探讨MIIP对鼻咽癌增殖、生长、侵袭、转移等恶性生物学行为的影响。方法:1.采用qRT-PCR法及Western blot法检测人永生化鼻咽上皮细胞NP-69细胞株,人鼻咽癌细胞株CNE-1、CNE-2、5-8F、6-10B、SUNE1、HNE-1 中MIIPmRNA及蛋白的表达情况。2.分别选取相对高表达MIIP的细胞CNE-1,瞬时转染si-MIIP下调MIIP表达,选取相对低表达MIIP的细胞5-8F,慢病毒转染上调MIIP表达;平板克隆形成实验观察细胞增殖,Transwell小室法检测细胞迁移、侵袭能力,流式细胞术观察细胞周期的变化。结果:1.鼻咽癌各细胞株中MIIP mRNA的表达均显著低于NP69(p<0.05)。MIIP基因在鼻咽癌细胞中呈相对低表达或缺失,在正常鼻咽上皮细胞表达较高,差异有统计学意义(P<0.05);高侵袭转移能力亚株较高分化细胞株MIIP表达明显下降。2.Si-MIIP组与对照组相比CNE-1细胞的克隆形成率增加了40%(p<0.001);过表达MIIP组与对照组相比5-8F细胞的克隆形成率降低了50%(p<0.001)。3.细胞迁移实验表明,si-MIIP组CNE-1细胞迁移到下室的个数为150.45 ±10.43,对照组为44.45 ±8.45,差异有统计学意义(p<0.001);过表达MIIP组5-8F细胞迁移到下室的个数为60.88 ±12.66,对照组为201.32 ±11.67,差异有统计学意义(P<0.001)。细胞侵袭实验表明,si-MIIP组CNE-1细胞穿过Matrigel胶的个数为100.66 ± 8.18,对照组34.03 ± 6.46,差异有统计学意义(p<0.001);过表达MIIP组5-8F细胞穿过Matrigel胶的个数为43.03 ± 10.77,对照组为144.16 ± 10.31,差异有统计学意义(p<0.001)。4.流式结果显示,CNE1细胞中,si-MIIP组与对照组相比,G1期细胞比例显著降低(p<0.01),G2/M期细胞比例显著增加(p<0.01);5-8F细胞中,G1期细胞比例显著增加(p<0.01),G2/M期细胞比例显著下降(p<0.01)。结论:体外实验证实了 MIIP可抑制鼻咽癌的一系列恶性生物学行为,包括肿瘤发生、增殖、侵袭、转移等。第三部分 MIIP影响鼻咽癌恶性生物学行为的相关机制目的:检测并分析鼻咽癌组织中MIIP与EGFR表达的相关性,初步探讨MIIP抑制鼻咽癌侵袭转移可能的分子机制。方法:1.免疫组化法检测96例鼻咽癌石蜡样本中EGFR的表达。分析EGFR的表达水平与预后的关系。Spearman等级秩相关分析MIIP、EGFR表达之间的相关性。2.siRNA沉默或慢病毒过表达MIIP基因后,western blot法检测CNE-1、5-8F细胞株中总EGFR及其磷酸化蛋白、PI3K/AKT通路及EMT中关键蛋白的表达变化。3.5-8F细胞中,应用外源性EGF刺激,观察细胞迁移能力的变化及AKT蛋白的变化。结果:1.MIIP表达见第一部分。EGFR阳性颗粒主要定位于细胞膜,在96例鼻咽癌组织中66例阳性表达(阳性率:68.8%);MIIP及EGFR的表达呈负相关(r=-0.780,p<0.01)。EGFR 阴性组 3 年无进展存率为 86.7%(95%CI:0.798-0.921),EGFR阳性组 3 年无进展存率仅为 71.2%(95%CI:0.659-0.772),但组间差异无统计学意义(p<0.109)。2.Western blot结果显示,沉默MIIP基因后,CNE-1细胞中EGFR、pEGFR、pAKT及Vimentin表达升高,E-cadherin表达下降;过表达MIIP基因后,5-8F 细胞中 EGFR、pEGFR、pAKT 及 Vimentin 表达明显下降,E-cadherin表达升高。3.应用外源性的EGF刺激后,NC组CNE-1细胞迁移能力明显增强(p<0.01),pAKT蛋白表达增加;而MIIP组5-8F细胞迁移能力无显著提高,pAKT蛋白表达也无明显增加。结论:MIIP基因的表达与EGFR表达呈负相关。MIIP表达增加可能通过抑制EGFR/AKT信号通路参与鼻咽癌EMT过程,诱导E-cadherin上调、Vimentin下调,从而影响鼻咽癌增殖、转移等恶性生物学行为。