富贵竹杆状病毒(LBBV)的鉴定及检测体系的建立

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富贵竹(Dracaenasanderiana)是广东省重要出口花卉种类之一,国内外尚未见任何病毒病的报道。国外出入境部门从我国进口的富贵竹上发现可疑的由杆状DNA病毒属(Badnavirus)病毒引起的症状,进而停止进口我国富贵竹。为了澄清事实真相,本研究对推测的富贵竹杆状DNA病毒进行了调查研究。调查发现在富贵竹上有明显的病毒病危害症状,主要表现为富贵竹叶片早期呈不规则退绿斑驳,叶尖稍有卷曲,后期发展为叶片脉明、叶色不均匀形成绿岛、叶片发黄及植株生长缓慢等症状。 从发病植株中抽提总DNA,通过分段PCR扩增和克隆测序,获得了富贵竹中含有的一种杆状DNA病毒(暂命名为富贵竹杆状病毒LuckyBambooBacilliformVirus,LBBV)的基因组全序列。经序列分析发现LBBV基因组序列全长7522bp,含有7个ORFs(典型的Badnavirus含有3个ORFs)。LBBV前3个ORFs的结构和大小与已报道的Badnavirus基本一致,推测编码的蛋白大小分别为17.58kDa、14.93kDa、214.77kDa;ORF3含有几个与BadnavirusORF3编码的多聚蛋白一致的高度保守基序,分别为天冬氨酸蛋白酶(Asparticprotease,AP)、反转录酶(Reversetranscriptase,RT)、RNA酶H(RibonucleaseH,RNaseH),还含有几个与已报道的Badnavirus一致的较为保守的基序,分别为运动蛋白区(Movementproteindomain,MP)、富含半光氨酸的锌指状的RNA结合区(Cysteine-richzincfinger-likeRNA-bindingregion,RB)、第二个富含半光氨酸区(Secondcystein-richregion,2ndCR)。LBBV后4个ORFs不是Badnavirus典型的ORFs。ORF4、ORF5非常小,包含在ORF3里面,ORF6的大部分在ORF3里面,小部分在ORF3的下游,ORF7在ORF3的下游。ORF4-7推测编码的蛋白大小分别为11.86kDa、11.31kDa、16.12kDa、11.00kDa。 将LBBV基因组全序列及各ORF推导的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST分析,搜索结果均为Badnavirus病毒的序列。对LBBV和其它Badnavirus病毒基因组全序列以及由ORF1-3推导氨基酸序列进行相似性比较分析,结果表明LBBV与其它Badnavirus基因组全序列相似率为36.0~46.6%,与柑桔黄花叶病毒(Citrusyellowmosaicvirus,CYMV)相似率最高,与甘蔗杆状病毒(Sugarcanebacilliformvirus,SCBV)相似率最低;LBBV与其它BadnavirusORF3氨基酸序列相似率为28.9~39.8%,与芋头杆状病毒(Tarobacilliformvirus,TaBV)相似率最高,与SCBV相似率最低;LBBV与其它BadnavirusORF1氨基酸序列相似率为12.5~42.7%,与TaBV相似率最高,与鸭跖草黄斑驳病毒(Commelinayellowmottlevirus,ComYMV)相似率最低;LBBV与其它BadnavirusORF2氨基酸序列相似率为11.8~22.6%,与CYMV相似率最高,与可可肿枝病毒(Cacaoswollenshootvirus,CSSV)相似率最低。ORF3的相似率整体上比ORF1、ORF2的相似率高,这与Badnavirus的ORF3较保守是一致的。进化树分析说明在核苷酸水平上LBBV与CYMV亲缘关系最近,在氨基酸水平上LBBV与TaBV亲缘关系最近。 LBBV基因组结构分析以及基因组序列与其它Badnavirus基因组序列的比较分析说明LBBV是属于Badnavirus的一种新病毒。 本研究对提纯的病毒核酸进行LBBV特异PCR检测,进一步证实富贵竹中存在LBBV。 以富贵竹总DNA为模板的特异PCR检测发现,从广州芳村、花都、五山和湖北武汉、湖南长沙采集的富贵竹样品阳性检出率为100%,无症状的样品检测结果也为阳性。故怀疑富贵竹基因组含有整合的LBBV核酸序列。进一步的富贵竹总DNA的Southern-blot试验证实富贵竹基因组含有整合的LBBV核酸序列,而且是多处整合。 本研究拟建立LBBV的PCR检测体系,但由于富贵竹基因组含有整合的LBBV核酸序列,而导致PCR检测不能有效区分游离LBBV核酸序列和富贵竹基因组中整合的LBBV核酸序列,所以单纯PCR检测不能判断是否发生该病毒病,检测体系有待完善。本研究还探讨了富贵竹总DNA提取方法,发现在常规CTAB抽提缓冲液中加入1%(w/v)的PVP的改进的CTAB法能抽提到高质量富贵竹DNA。 本研究是关于富贵竹杆状DNA病毒LBBV的首次报道。
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