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背景宫腔粘连（intrauterine adhesions,IUA）是指子宫内膜因多种因素受损,从而出现内膜修复障碍,表现子宫内膜薄、月经异常（经量减少或闭经）。手术、激素治疗、物理屏障的放置是目前IUA治疗的主要方法,但是这些未能明显改善中重度IUA患者的生育能力,因此需要寻找新的治疗方法来促进子宫内膜的修复和再生,从而改善生殖能力。随着细胞治疗在组织损伤和修复中的发展,干细胞疗法在IUA中的研究越来越多,并且国内外大量研究表明干细胞对子宫内膜的修复具有一定的治疗效果。目前用于IUA研究的干细胞有胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和子宫内膜间充质干细胞等。其中经血源性间充质干细胞（menstrual derived mesenchymal stem cells,MenSCs）因来源广、可周期性获得、无创等优点,成为治疗IUA自体干细胞移植理想的细胞来源,但是单纯的干细胞灌注定植率较低,联合水凝胶可以增加干细胞在子宫内膜表面的粘附,有助于提高干细胞的存活和定植率。聚丙交酯-乙交酯/聚乙二醇/聚丙交酯-乙交酯（PLGA-PEG-PLGA）水凝胶是一种人工合成的温敏性水凝胶,在人体生理温度下可以变成凝胶,当温度在室温时变成溶胶,可用于原位注射。并且该水凝胶被证明无毒、对人体无害,是一种有潜力的载体介质。目前尚未有研究将MenSCs与PLGA-PEG-PLGA水凝胶构建细胞支架复合物的报道。本实验针对IUA所致薄型子宫内膜患者构建一种高效的MenSCs分离培养方法,并将MenSCs与改良的PLGA-PEG-PLGA水凝胶构建细胞支架复合物,检测其细胞在水凝胶中的增殖和释放能力,以期提高自体MenSCs移植治疗IUA的移植效率,从而提高IUA所致薄型子宫内膜患者干细胞移植的成功率。目的1.构建一种稳定、高效、可重复的IUA所致薄型子宫内膜患者MenSCs的分离培养体系,为干细胞移植治疗奠定基础。2.以MenSCs为种子细胞,温敏性水凝胶为支架制备细胞支架复合物,以期增加干细胞移植的成功率,从而提高IUA所致薄型子宫内膜患者的生育能力。方法1.将收集的月经血分别使用过滤法、全月经血培养法和密度梯度离心法分离MenSCs,观察细胞生长形态和细胞克隆的情况,确定MenSCs最佳的分离方法。并通过流式细胞仪检测干细胞表面标志物表达情况,体外成脂、成骨和成软骨分化实验来检测分离的细胞的多向分化潜能。2.利用紫外照射法、过滤法和高压蒸汽灭菌法对PLGA-PEG-PLGA水凝胶或共聚物除菌,确定除菌方式。通过除菌前后共聚物的结构、溶解时间、水凝胶的成胶温度的测定及体外降解实验分析除菌对水凝胶性能的影响。3.分别采用液体交换法和酸碱中和法对水凝胶进行改良,通过改良前后水凝胶中石蕊指示剂颜色变化、PH值、相变温度、渗透压评估改良方法对温敏性水凝胶性能的影响,从而选择合适的改良方法。4.MenSCs与PLGA-PEG-PLGA水凝胶按一定比例混合,通过活死细胞染色鉴定、流式细胞术和PI染色评估改良前后及改良后不同浓度水凝胶对MenSCs的细胞毒性。利用免疫荧光染色和发光检测法检测MenSCs在水凝胶中的增殖和扩散情况,评估MenSCs与PLGA-PEG-PLGA水凝胶构建细胞支架复合物的相容性。结果1.使用过滤法、全血培养法、密度梯度离心法均能分离长梭形、贴壁生长的MenSCs,其中过滤法培养的MenSCs细胞形态较为一致,并且细胞克隆团最多,是最佳的分离方法。流式细胞仪检测到分离的细胞高表达CD73、CD90和CD 105,不表达CD34、CD45、CD11b、CD19和HLA-DR。成脂诱导分化可见被油红O大量红染的脂滴,成骨诱导分化可见被茜红素染成橙色的钙盐,成软骨染色可见蓝染的蛋白,说明所培养的细胞具有间充质干细胞的特性。2.与紫外照射法和过滤法相比,高压蒸汽灭菌法具有可行性。高压蒸汽灭菌前后共聚物的结构未发生明显变化,溶解时间明显缩短,并且所配制的水凝胶均具有温敏特性,相变温度相似,有利于水凝胶的快速制备和下一步实验的应用。3.液体交换法和酸碱中和法均能使紫色石蕊指示剂变为蓝色。未改良、经液体交换改良与酸碱中和改良的水凝胶PH值分别为3.02±0.03、7.44±0.07、7.44±0.07。两种方法改良的水凝胶相变温度相近。经酸碱中和改良的7.5%、10%、15%、20%水凝胶的渗透压分别为 347.33±2.52、375±2.00、405±1.52、486.67±3.51 mOsmol/kg,而经液体交换法改良的水凝胶渗透压分别为310.33±2.51、315.33±1.15、314±1.00、315.67±0.58 mOsmol/kg。液体交换法改良的水凝胶因更加接近生理的PH值和渗透压,可用于后续的实验研究。4.活死细胞染色和流式细胞仪检测显示,随着时间的延长,MenSCs在未改良的水凝胶中活细胞明显减少,死细胞明显增多,5h活细胞和死细胞的比例分别为0.15±0.07%、94.95±0.78%。而在经液体交换法改良的水凝胶中,活细胞极多,死细胞极少,5h活细胞和死细胞的比例分别为94.95±0.78%、5.00±0.70%。PI发光法检测改良后不同浓度水凝胶（0%、5%、10%、15%、20%）中MenSCs的死亡情况,结果发现在浓度为10%的水凝胶中,死细胞的发光强度相对较少。并且与浓度为0的水凝胶相比,它的PI发光强度较低。免疫荧光染色和发光检测法结果显示在改良水凝胶中的MenSCs前3天生长较快,并且87.47%的细胞从水凝胶中释放出来。说明改良后的水凝胶可以提供细胞增殖与释放的环境,并且在一定程度上对细胞具有保护作用。结论1.建立稳定的IUA所致薄型子宫内膜患者MenSCs分离培养体系。2.成功构建MenSCs与PLGA-PEG-PLGA水凝胶的细胞支架复合物,该水凝胶是一种良好的细胞3D培养和缓释支架。