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灰树花(Grifola frondosa)是一种大型药食兼用珍稀菌,主要分布于亚热带至温带,又名栗蘑、贝叶多孔菌等。研究表明,灰树花子实体中的多糖具有多种生物活性,如抗肿瘤、抗氧化、增强免疫、抗高血压、降低血糖和血脂等。近年来酶法在中药提取中的应用已显示出明显的优势,酶法可以破坏植物细胞壁,有利于对有效成分的提取。已有研究表明灰树花多糖的分子量较大,且低分子量灰树花多糖显示出较好的抗肿瘤等方面的生物活性。而目前对酶法提取灰树花多糖的研究很少,且未见酶解灰树花多糖结构鉴定及抗氧化活性的报道。因此,本论文对比研究热水及复合酶法提取灰树花子实体多糖,并对其纯化、结构表征及抗氧化活性进行研究,为灰树花多糖功能食品和药品的研究开发提供科学依据。主要研究内容和结果如下:
1.水提及酶法提取灰树花多糖的工艺研究。提取工艺条件为料液比1:10、3％的单一酶(纤维素酶、果胶酶或胰酶)或复合酶(纤维素酶:果胶酶:胰酶=2:2:1)、温度100℃、时间3 h、提取3次,该工艺条件下,热水提取灰树花粗多糖(GFP)的得率为13.9％,多糖含量21.3％；单一酶法提取灰树花粗多糖的得率分别为18.6％、19.3％和21.4％,多糖含量分别为34.6％、31.8％和36.5％；而复合酶法提取灰树花多糖(FGFP)的得率和含量分别为21.2％和39.6％。与水提法相比,复合酶法提取多糖的得率和含量均为水提的近2倍,说明复合酶法适合灰树花多糖的提取。
2.水提及复合酶法提取灰树花多糖的分离纯化。经三氯乙酸脱蛋白,DEAE-52纤维素和Sephacryl S-500HR凝胶柱分离得到3个灰树花多糖组分(GFP-11、GFP-22和GFP-33)和2个复合酶解多糖组分(FGFP-11和FGFP-22)。各组分多糖在HPLC图谱上呈单一对称峰,表明多糖各组分为均一多糖组分。
3.多糖各组分的分子量和单糖组成测定。采用高效液相色谱法和气相色谱法测定各组分多糖的分子量和单糖组成,结果表明,水提灰树花多糖组分GFP-11、GFP-22和GFP-33分子量分别为1907655,1945360和2655828；复合酶提多糖组分FGFP-11和FGFP-22分子量分别为59815和110496。GFP-11由甘露糖,葡萄糖和半乳糖组成,其摩尔比为甘露糖:葡萄糖:半乳糖=1:2.0284:9.2507；GFP-22是由葡萄糖和半乳糖组成,其摩尔比为葡萄糖:半乳糖=1:30.9625；GFP-33是由甘露糖组成。FGFP-11由甘露糖,葡萄糖和半乳糖组成,其摩尔比为甘露糖:葡萄糖:半乳糖=1:16.3579:5.2486:FGFP-22是由葡萄糖组成。
4.多糖各组分的结构表征。运用紫外光谱(UV)、红外光谱(IR)及刚果红试验等现代分析方法和理化分析手段对水提多糖(GFP-11、GFP-22和GFP-33)及复合酶解多糖(FGFP-11和FGFP-22)进行表征,并通过核磁共振(13C-NMR和1H-NMR)分析组分FGFP-11的结构。IR结果表明,各组分多糖均具有多糖的特征吸收峰；NMR确定了纯化组分FGFP-11多糖结构中存在α糖苷键构型；刚果红实验证明,GFP-11、GFP-22和FGFP-11均具有三螺旋立体构型。
5.灰树花及复合酶解多糖纯化前后的抗氧化活性研究。灰树花及复合酶解多糖纯化前后对三种自由基(·OH、DPPH·、ABTS+)均有一定的清除作用,且复合酶解FGFP及纯化后组分FGFP-11的抗氧化活性明显优于酶解前GFP。相关性分析表明复合酶解多糖较高的抗氧化活性与其较低的分子量有较好的相关性。本试验结果为抗氧化药物或功能食品的研究开发提供了依据。