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猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种急性、高度传染性肠道疾病。自1984年起,PEDV G1a亚型一直是引起我国仔猪腹泻的重要病原,给养猪业造成了巨大的经济损失。2010年开始,我国南方多个省份暴发了由PEDVG2b亚型变异毒株引起的仔猪腹泻,并迅速蔓延至全国。与经典的G1a亚型毒株相比,新出现的G2b亚型毒株致病性更强。由于G1a亚型疫苗株CV777不能针对G2b亚型变异毒株提供有效的保护,因此迫切需要研制G2b亚型变异毒株疫苗。本研究调查了 2015～2017年间江苏省部分规模化猪场PEDV G2b亚型变异株的流行状况,并对本实验室分离鉴定的1株G2b亚型变异株进行传代致弱,为进一步研制弱毒疫苗奠定了基础。1、江苏省2015～2017年PEDV G2b亚型变异株的流行状况调查2015～2017年间,从江苏省发生仔猪腹泻的规模化猪场收集临床病料176份,通过实时荧光定量PCR方法从中检测出19份PEDV阳性。对这19份阳性病料中的PEDV进行分离鉴定,成功分离到1株G2b亚型毒株(命名为PED-JS-2016-05-4)。以PCR从19份PEDV阳性病料中扩增PEDV的纤突蛋白(S)基因,测序和遗传进化分析,发现其中17份为G2b亚型变异株,另外2份为G1b亚型毒株。检测到的G2b亚型变异株与国内外报道的G2b亚型变异株的S基因核苷酸同源性高达98.5～99.7%;与G1a亚型疫苗株CV777及其他毒株亲缘关系比较远,S基因核苷酸同源性为93.6～94.3%。检测到的2个G1b亚型毒株与在美国最早发现的该亚型代表毒株OH851的S基因核苷酸同源性高达99.5%;与G1a亚型毒株S基因核苷酸同源性只有95.6～96.8%。研究表明,当前江苏省主要流行的PEDV毒株为G2b亚型变异株。本研究检测到的G2b亚型变异株与CV777疫苗毒株在S蛋白中和表位区存在较多的氨基酸差异,并且主要集中在COE中和表位区,在SS6中和表位区只存在1个突变,SS2和2C10中和表位区没有突变。此外,通过CBS在线软件包进行S蛋白潜在糖基化位点预测发现,与CV777疫苗毒株相比,17株G2b亚型变异株具有6个相同的潜在糖基化位点突变,其中3个位点氨基酸突变(N57V,N127I,T232I)导致对应部位的潜在糖基化位点缺失,而另外3个氨基酸位点突变(S59N,I116T,T1193N)产生了新的潜在糖基化位点。与CV777相比,2株G1b亚型毒株只有1个潜在糖基化位点存在差异,即1193位氨基酸由T突变为N产生了一个新的潜在糖基化位点。2、PEDV G2b亚型变异株JSX2014的致弱研究选取实验室前期分离鉴定的PEDV G2b亚型变异株JSX2014进行致弱研究,以期培育弱毒疫苗株。JSX2014毒株在Vero细胞连续传代后产生的典型CPE为:细胞肿胀、变圆,细胞单层形成网眼状并逐渐崩解脱落。JSX2014毒株在细胞上可以形成大小不同的空斑,推测与不同代次病毒的复制能力有关。为了筛选到复制能力较好的毒株,在传代过程中分别挑取形态大小差异明显的空斑,进行空斑纯化,通过测定TCID50来评价不同空斑克隆株的复制能力。结果表明,大空斑克隆株复制能力显著优于小空斑克隆株。因此,多次挑取大空斑进行克隆化,连续传代至130代,获得的毒株命名为JSX2014/ATT。选取未吸吮母乳的3日龄初生仔猪对JSX2014/ATT进行致病性试验,每只仔猪肌肉注射2 ×107TCID50的病毒。每天观察是否有呕吐和腹泻等临床症状,并采集肛拭子以及血液进行PEDV检测。5 d后处死仔猪,对肠管进行组织病理学检查。结果显示,感染仔猪未出现腹泻相关的临床症状;仅在第1 d血液中检测到PEDV,肛拭子中不能检测到PEDV;仔猪肠组织结构完整,肠绒毛未发生萎缩、脱落,表明JSX2014/ATT株已经致弱。对JSX2014/ATT株的全基因组进行测序,并且与原始的JSX2014株作了比较。两者在S基因上共有11个核昔酸发生突变,E和N基因都只有一个核苷酸发生突变,M基因除了 2个核苷酸的突变外还有1个15 nt的插入。非结构基因的突变主要集中在ORF1ab上,共有13个核苷酸发生突变,ORF3在第14位核苷酸插入一个T而导致翻译提前终止。综上所述,江苏省近期的PEDV流行毒株为G2b亚型变异株,同时也存在少量G1b亚型毒株。通过Vero细胞连续传代结合病毒空斑纯化技术,成功致弱了一株PEDV G2b亚型变异株,为进一步研制弱毒活疫苗奠定了基础。