线粒体是存在于大部分复杂细胞中的一种重要的细胞器,它具有典型而独特的双层膜结构,负责为细胞的各种代谢生理活动提供能量支持。作为细胞进行有氧呼吸的核心,线粒体利用氧与碳水化合物和脂肪反应,释放活性氧(ROS)和生化能。在线粒体呼吸链中,巯基化合物在调节ROS的动态平衡中起着重要的作用。线粒体中的半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hcy)对线粒体氧化应激敏感,并导致肝脏损伤、虚弱和阿尔茨海默病等多种疾病。因此,实时监测线粒体中半胱氨酸和同型半胱氨酸水平对于揭示这些氨基酸在ROS稳态中的作用具有重要意义。荧光探针由于其灵敏度高、选择性强等优点,被认为是生物系统中监测细胞内半胱氨酸和同型半胱氨酸的最有力工具。不幸的是,大多数报告的半胱氨酸和同型半胱氨酸荧光探针未能针对活细胞中的线粒体。截至目前,大多数文献报道的荧光探针主要是是基于单光子技术设计(OPM)。由于其短的激发波长,和其它不完善之处,例如光子漂白,光损伤,细胞自体荧光以及对穿透深度浅(<80μm)等原因。限制了它们在深层组织和生物体内的应用。最近,双光子显微镜(TPM)已成为领先的成像技术在生物学研究中具有明显的优势,如局域激发,增加穿透深度,并减少光漂白和光损伤。考虑到固有的复杂有机体的不断进化,比率型测量优于单一的发射强度测量,因为它可以消除环境变化,探针分布不均等多种可能的影响,从而提供更准确的分析。因此,我们在阅读大量荧光探针类文献的基础上,设计并合成了一种基于喹啉的双光子荧光基团的新型比率计量型双光子荧光探针(Mito-MQ)用于检测线粒体内半胱氨酸和同型半胱氨酸。主要研究内容如下:1)在荧光探针(Mito-MQ)中醛基与喹啉骨架直接相连,作为半胱氨酸和同型半肮氨酸的特异反应点。同时,在荧光基团的另一端连接三苯基磷盐基团(TPP),TPP是广泛使用的线粒体靶向基团,将其连接到荧光基团用于实现探针定位在线粒体的目的。由于分子内电荷转移(ICT)机理Mito-MQ具有优良的双光子荧光性能。核磁结果和紫外分析表明,在Mito-MQ中醛基可以通过环化反应与半胱氨酸/同型半胱氨酸形成噻唑烷/噻嗪烷。比率荧光检测信号表明Mito-MQ与半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hcy)反应后发生蓝移(从517 nm蓝移到460 nm)而对谷胱甘肽(GSH)无响应,反应过程响应速度快(10分钟)。通过1H-NMR检测,ESI-MS和理论计算验证了相关反应机理。2)Mito-MQ和线粒体商染得共定位系数是0.87,表明探针主要存在于线粒体,因此,Mito-MQ被成功应用于检测线粒体氧化应激过程中Cys、Hcy 水平的变化。此外,我们还研究了 Mito-MQ在新鲜组织切片成像性能,Mito-MQ在双光子激发下能在深部组织工作(约130μM)。此外,我们还进行了相关的活体实验,实验表明探针可用于斑马鱼体内Cys和Hcy含量的测定。