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研究背景：作为一种高效的基因调控手段，RNA干扰具有靶点专一、用量小等优点，被广泛应用于基因治疗等领域。传统的短发夹RNA载体虽然解决了常规小RNA短时效的缺点，但却伴随严重的细胞毒作用。基于內源microRNA的新一代人工microRNA载体（amiRNA）可以很好解决载体安全性问题，表达效率却不尽如人意。如何提高amiRNA载体的表达效率是目前小RNA载体急需解决的问题，amiRNA载体的优化工作对推动RNA干扰研究及其基因药物的发展意义重大。研究目的：本论文的主要目的是解决目前amiRNA载体表达中存在的瓶颈问题，获得高表达效率的新型amiRNA载体，加速小RNA基因药物的临床应用。研究方法：（1）利用Block-iT RNAi Designer软件设计靶向人端粒酶逆转录酶基因的amiRNA序列；（2）通过荧光定量、Western-Blot、Telochaser、细胞增殖、迁移、凋亡、血管生成、移植瘤实验来分析amiRNA的沉默效应和抗肿瘤活性；（3）借助报告基因沉默实验和基因芯片技术分析amiRNA的特异性和安全性；（4）依据miRNA引导序列的长度、指纹图谱、自由能等特征值差异来确定不同物种间miRNA表达框的通用性；（5）根据主要miRNA引导序列的表达丰度筛选出理论上具有高表达效率的表达框；（6）已验证的amiRNA序列、miRNA表达框和自身互补型腺相关病毒（scrAAV）通过重组产生scrAAV-amiRNA质粒载体；（7）三质粒共转法包装scrAAV-amiRNA病毒载体；（8）应用荧光定量和蛋白电泳技术对scrAAV-amiRNA病毒进行表征；（9）采用stem-loop RT qPCR来评价scrAAV-amiRNA病毒对目的amiRNA的表达效率；（10）使用小RNA深度测序来构建amiRNA成熟序列的表达图谱。研究结果：（1）成功筛选2条特异性抑制肿瘤细胞增殖、迁移与血管生成，促进肿瘤细胞凋亡、靶向人端粒酶逆转录酶基因的amiRNA序列；（2）以商品化表达框为基础的scrAAV-pcDNA6.2-amiRNA载体能表达目的amiRNA，但表达量低，沉默效应不显著；（3）不同物种间miRNA表达框的通用性跟物种间的进化关系相吻合；（4）优化后的scrAAV-opt-amiRNA载体表达效率最大提高近6倍；（5）scrAAV-opt-amiRNA表达的成熟序列多为异构序列，有效序列比例偏低。研究结论：（1）通过miRNA深度测序分析可以实现amiRNA载体的表达优化；（2）有效amiRNA成熟序列的含量是amiRNA载体表达优化的重要指标。