目的以程序性死亡受体-1/程序性死亡受体-配体1(PD-1/PD-L1)抑制剂为代表的免疫检查点抑制剂已成为晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者治疗的重要选择之一。但它并非对所有NSCLC患者都有效,提高疗效的关键之一在于筛选“优势人群”。一方面,肿瘤组织PD-L1表达水平是PD-1/PD-L1抑制剂疗效预测的重要生物标志之一。目前PD-L1表达检测采用肿瘤组织标本,其取材方式属有创操作。组织PD-L1表达水平本身存在时空异质性,小标本与手术标本的活检结果不一致率较高。另一方面,外泌体携带大量DNA、RNA和蛋白质等生物活性物质,在细胞通讯中起重要作用,可通过多种机制调节免疫系统功能,从而影响免疫治疗疗效。因此,本研究旨在:(1)明确NSCLC外泌体PD-L1(ePD-L1)检测的可行性,并探索其与原肿瘤细胞PD-L1表达水平的关系。(2)明确NSCLC患者与健康人血浆外泌体miRNA表达谱的差异,并探索血浆外泌体miRNAs作为NSCLC抗PD-1/PD-L1治疗疗效预测生物标志物的潜力。从而进一步完善免疫治疗可获益人群的筛选标准,使更多NSCLC患者能从免疫治疗中获益。方法本研究主要分为两大部分。第一部分:选取2种肺癌细胞系H226(PD-L1弱阳性)、H1975(PD-L1强阳性)和1种乳腺癌细胞系MCF7(PD-L1阴性)进行培养,超高速离心法分离细胞培养液中外泌体,以外泌体特异性蛋白标记物CD9为外泌体标记,采用蛋白质免疫印迹法检测各细胞系释放外泌体含量、PD-L1和ePD-L1表达水平,分析PD-L1和ePD-L1表达水平的相关性。第二部分:本研究前瞻性收集于本中心接受抗PD-1/PD-L1治疗的EGFR/ALK野生型晚期NSCLC患者用药前基线血浆标本,每治疗3个周期进行1次疗效评价,同时收集血浆标本,直至患者病情进展。根据疗效评价结果,选取最佳疗效为完全缓解或部分缓解(CR/PR组)及疾病进展(PD组)患者样本,同时收集7例健康人血浆作为对照。超高速离心提取血浆外泌体,小RNA测序分析外泌体miRNA。比较健康人与NSCLC患者、CR/PR组与PD组基线及CR/PR组治疗前后外泌体miRNA谱的差异,明确健康人与NSCLC患者miRNA谱的差异,并探索可能作为PD-1/PD-L1抑制剂疗效预测生物标志物的外泌体miRNAs。结果第一部分:H1975和MCF7细胞系外泌体检测到较强CD9表达,但是H226分泌的外泌体CD9水平很低。MCF7、H226和H1975细胞系PD-L1表达水平分别为阴性、弱阳性、强阳性,ePD-L1表达水平分别为阴性、阴性、强阳性。第二部分:本研究总共收集到5例PR患者和4例PD患者。通过主成分分析(PCA)聚类法,癌症患者的外泌体miRNA谱可以与健康人的外泌体miRNA谱区分开来,免疫治疗后的样本也可与治疗前的样本区分开。在晚期NSCLC中,共有120个外泌体miRNA与健康个体相比存在差异(FDR<0.01,P<0.05,by exact test)。PD组患者与PR组患者和健康个体miRNA谱相比,miR-320家族的三个miRNA(miR-320d、miR-320c、miR-320b)被发现上调。此外,通过对比PR组治疗前后miRNA谱的变化,我们找到了311个差异表达miRNA(包括111个上调和200个下调的miRNA),尤其是下调的miR-125b-5p(logCPM>4,P<0.05,FDR≤0.1)。miR-125b-5p是一种已知的γδT细胞抑制因子。基于此结果,miR-320家族和miR-125b-5p或可作为免疫治疗的预测的生物标志物。结论血浆ePD-L1水平受肿瘤组织本身PD-L1表达水平和其外泌体释放量的双重影响。在ePD-L1表达呈阳性时,可反应肿瘤组织PD-L1表达水平;反之,在ePD-L1检测呈阴性的情况下,建议以肿瘤组织PD-L1的检测结果为准。非小细胞肺癌患者血浆外泌体miRNA谱与健康人不同,miR-320家族可能为EGFR/ALK野生型晚期NSCLC抗PD-1/PD-L1治疗疗效预测的潜在生物标志物,治疗过程中T细胞抑制因子miRNA-125b-5p的下调可能代表NSCLC患者对免疫治疗反应良好。