现行的水蛭质量控制模式主要包括传统形态学鉴定、化学定性鉴别以及含量测定,2010版《中国药典》收载的水蛭质量控制标准中,含量测定方法是采用凝血酶滴定法,利用抗凝血酶活性来定义水蛭的效价,但凝血酶滴定法存在很多的问题,如需人为的判断滴定的终点,且不同实验人员对终点的判断存在较大的误差,同时在滴定的过程中,每滴加一滴凝血酶,就需要震摇一次,前期形成的纤维蛋白被破坏,导致滴加过量的凝血酶才能凝固。另外,使纤维蛋白原凝固,需要滴加过量凝血酶,对于抗凝血酶效价接近的水蛭药材,在最后一滴凝血酶滴加之后,有的很快就能凝固,有的需要较长的时间才能凝固,这说明反应体系中剩余的凝血酶的量是不同的,水蛭中所含的抗凝血酶单位也不相同,但本课题判断其所含的抗凝血酶单位是相同的。特别是对于基源为日本医蛭的水蛭,凝血酶的滴加量会达到原反应体系的一半,改变了反应体系,测定的结果是不准确的。因此现行的水蛭质量控制方法准确度和客观性存在不足。在建立体外质量控制反应体系之前,本课题对水蛭饮片和水蛭成药制剂脉血康的几个主要药理作用进行深入的实验研究,通过科学设计给药剂量与实验指标,为保证水蛭在临床中安全有效的使用,提供基础性研究资料。药效学研究发现水蛭对凝血时间APTT和TT有显著的延长作用,并且有一定的量效关系；在离体实验研究中发现,水蛭体外对APTT和TT也有显著的延长作用,量效关系明显。因此,本实验以该生物效应为基础,以生物统计为工具,运用特定的实验设计,量化药物的生物活性,建立水蛭延长凝血时间TT的生物活性检定方法学。实验主要包括水蛭整体药效学实验、水蛭离体实验研究和水蛭生物活性测定方法的建立3个部分内容,下面分别进行论述。第一部分：水蛭整体药效学实验研究水蛭和脉血康对急性血瘀模型大鼠凝血系统影响的实验。本课题选择了肾上腺素血瘀模型,通过皮下注射盐酸肾上腺素复合冰浴造成急性血瘀模型,考察凝血相关指标APTT, PT, TT,纤维蛋白原的含量和6min内血小板的最大聚集率等指标。实验结果发现,水蛭能显著延长凝血时间APTT和TT,显著降低5min内的血小板聚集率等作用。因此水蛭抗凝血和抗血栓的作用可能与改善血液流变学,延长凝血时间APTT, TT以及降低血小板聚集率等作用有关。二、水蛭对高凝动物血液流变学和凝血系统影响的实验研究。本课题通过尾静脉注射鞣花酸溶液,造成高凝小鼠模型；通过舌下静脉注射鞣花酸溶液造成高凝大鼠模型。考察小鼠断尾出血时间、毛细管凝血时间和大鼠全血粘度、血浆粘度以及凝血时间APTT,PT、TT和纤维蛋白原的含量。实验结果发现,水蛭能显著延长小鼠断尾出血时间和毛细管凝血时间,显著降低高凝大鼠全血粘度、血浆粘度,显著延长凝血时间APTT, PT和TT。因此,水蛭抗高凝动物血瘀作用与显著改善上述指标有关。三、水蛭对正常小鼠出血时间和凝血时间影响的实验研究。正常小鼠连续给药后,考察断尾出血时间和毛细管凝血时间,摘眼球取血法考察血浆凝血时间APTT, PT, TT和纤维蛋白原的含量。实验结果发现,水蛭可显著延长正常小鼠的断尾出血时间和毛细管凝血时间,显著延长凝血时间APTT和PT。说明,水蛭对正常动物凝血系统也有显著性的影响。第二部分：水蛭离体实验研究通过查阅文献,本课题选取了6个水蛭体外实验,分别为：凝血酶滴定实验、水蛭体外抗血小板聚集实验、水蛭体外对凝血酶原(PT)影响实验、水蛭体外对活化部分凝血酶时间(APTT)影响实验、水蛭体外对血浆-凝血酶时间(TT)影响实验以及水蛭体外对纤维蛋白原-凝血酶时间(Fibg-TT)影响实验。基于上述体外实验,对不同浓度水蛭提取液和体外效应分别进行了考察,以期找出量效关系较好的实验体系。实验结果发现：对于2010版《药典》中的凝血酶滴定法所存在的问题,前文已进行说明。体外抗血小板聚集实验,结果本课题发现,不同浓度的水蛭浸提液均有不同程度的促进血小板聚集的作用,与预期抑制血小板聚集作用相反。体外凝血酶原(PT)时间法,结果发现,水蛭体外对凝血酶原时间末见显著性的影响。活化部分凝血酶时间(APTT)法,结果发现,水蛭提取液在一定的浓度范围内,凝血时间与水蛭浸提液的浓度呈现较好的线性关系。血浆-凝血酶时间法(血浆-TT法),结果发现,水蛭提取液在一定浓度范围内,对数凝血时间TT与水蛭浸提液的浓度有一定的线性关系。纤维蛋白原-凝血酶时间(Fibg-TT)法,结果发现,在一定浓度范围内,对数凝固时间与水蛭浸提液浓度呈现较好的线性关系。第三部分：水蛭体外生物活性测定方法的建立根据整体药效学实验与离体实验研究的结果,本课题找出整体药效学与离体实验具有一致性的实验体系,用于建立水蛭生物活性测定方法。整体药效学实验与离体实验具有一致性和相关性的实验体系有：活化部分凝血酶时间法(APTT法)、血浆-凝血酶时间(血浆-TT法)和纤维蛋白原-凝血酶时间法(Fibg-TT法)。因Fibg-TT法量效关系明显,实验结果的重复性和稳定性均较好,因此可选用Fibg-TT法作为建立水蛭生物活性测定的实验体系。因蚂蟥／柳叶蚂蟥与水蛭(日本医蛭)体外抗凝效果和量效关系曲线存在较大的差异,因此,本课题就上述两类水蛭分别建立了生物活性测定方法。因水蛭素不能完全代表水蛭的抗凝活性,根据中药生物活性测定的指导原则,应首选中药作为标准品,因此本课题就上述两类水蛭定义了标准品,进行了反应体系的建立,量效关系考察,标准品的建立及效价的定义,并进行了效价的测定,最后对该方法进行实验室内的方法学考察。同时,APTT法量效关系也比较显著,在一定的浓度范围内,水蛭浸提液的浓度与APTT呈现较好的线性关系,因此,本课题同样可基于水蛭延长凝血时间APTT建立水蛭体外生物活性测定方法。同样,本课题进行了反应体系的建立,量效关系考察,标准品的建立及效价的定义,并进行了效价的测定,最后对该方法进行实验室内的方法学考察。根据所建立的水蛭生物活性测定方法：Fibg-TT法,本课题进行了效价的测定,结果可靠性检验通过,可信限率低(小于10%)。同时对该方法进行了实验室内的方法学考察：精密度考察(加标回收率实验)、重复性考察、中间精密度考察以及方法适用性考察,结果发现,上述指标结果均较好,说明此方法具有可行性、重复性和准确性,可以用于水蛭生物活性测定,用于控制其质量。