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课题一 单核趋化因子-1促进间充质干细胞在扩张型心肌病中的归巢背景：扩张型心肌病(Dilated Cardiomyopathy, DCM)是导致心力衰竭最常见的非缺血性心肌病。间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)移植作为治疗DCM的极具潜力的方法是目前研究的热点。然而关于静脉移植MSCs对DCM的治疗作用报道相对较少,DCM中MSCs向心脏组织归巢的机制也尚不清楚。方法：从C57/BL6小鼠骨髓分离培养出小鼠MSCs并在体外进行扩增培养。通过腹腔注射盐酸阿霉素构建DCM模型。MSCs或生理盐水经颈内静脉注射到小鼠体内。移植后4周超声心动图及血流动力学评估心脏功能包括缩短分数,左室舒张末内径,左室收缩末压及左心室压最大上升速率。Masson三色染色检测心肌纤维化水平。应用RT-PCR检测心肌组织中单核趋化蛋白-1 (monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)、基质细胞衍生因子-1 (stromal cell-derived factor-1, SDF-1)、巨噬细胞炎症蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1α (MIP-1α)及单核趋化蛋白-3 (monocyte chemotactic protein-3,MCP-3) mRNA表达水平。Western blot验证心肌中MCP-1蛋白表达水平。Western blot及流式细胞仪测定MCP-1的受体C-C chemokine receptor type 2 (CCR2)在MSCs表达情况。利用transwell小室方法检测MCP-1对MSCs体外的趋化作用,体内实验通过观察抑制了MSCs的CCR2表达后对其向心肌趋化的影响进一步证实MCP-1/CCR2信号通路在MSCs向扩张的心肌归巢中的作用。结果：静脉移植MSCs可明显改善DCM小鼠的心功能并减轻其心肌纤维化。DCM心肌中MCP-1基因及蛋白水平都较正常对照组显著升高,而SDF-1,MIP-1α及MCP-3则无明显变化。MSCs表面表达MCP-1受体CCR2。MCP-1在体外可促进MSCs的迁移,抑制了MSCs的CCR2的表达后可减少MSCs向扩张的心肌的归巢量。结论：本研究显示静脉移植MSCs能够改善DCM的心脏功能,并发现这种过程是MCP-1/CCR2信号通路参与了MSCs在DCM中的归巢所致,为MSCs治疗DCM提出了新的治疗靶点。课题二 人心脏来源的iPS细胞系的建立及在小鼠心肌梗死模型中的应用背景：可诱导的多能干细胞(Induced pluripotent stem cells, iPSCs)具有保持其来源组织表观遗传特性的记忆功能。这种表观遗传记忆可以影响iPSCs的分化及其分化的细胞相应的功能。因此我们设想心脏来源的iPSCs在治疗心肌损伤方面可能会有更为出色的表现。方法：从心力衰竭病人心肌组织中分离培养出心脏成纤维细胞,以Oct3/4、Sox2,.Klf4和cMyc作为编程基因,通过仙台病毒感染的方式将其重编程为人的iPSCs (hciPSCs)。hciPSC建立成功并经生物学鉴定后,利用细胞因子Activin A、BMP4和bFGF在体外诱导其向心肌细胞分化。结扎小鼠左冠状动脉前降支建立心肌梗死模型。将分化的心肌细胞形成的细胞膜片移植到心肌梗死的小鼠心脏上,4周后通过人特异性抗体Human specific nuclei antibody (HNA)及 Human specific cardiac troponinT (hcTNT)免疫荧光染色方法评估移植细胞的存活率及成熟情况,超声心动图测定心脏功能,TUNEL染色观察小鼠心肌细胞凋亡情况,内皮细胞特异性抗体CD31染色检测心肌组织血管密度。结果：我们成功地将人的心脏成纤维细胞重编程为hciPSCs,对其生物学鉴定显示hciPSCs保持正常的细胞核型,表达多能分化的标志Tral-60、SSEA4和Oct4,多能基因Oct3/4、Sox2和Nanog表达量与成熟的iPS细胞系相似,在免疫缺陷的小鼠体内可形成具有三个胚层结构的畸胎瘤。hciPSCs可在体外高效地分化为心肌细胞(效率可达92%以上)。分化的心肌细胞形成的细胞膜片移植到心肌梗死小鼠心脏4周后通过计算心肌组织中HNA和hcTNT阳性细胞数量得到移植细胞存活率可达30%以上。与移植后1天相比,移植的心肌细胞显示出更为清晰的细胞骨架,排列更加规律。移植后4周细胞移植组左室射血分数(left-ventricular ejection fraction,EF%)及缩短分数(fractional shortening, FS%)都较心肌梗死组明显升高(p<0.05)。TUNEL染色可见细胞移植组小鼠心肌中TUNEL阳性细胞数明显少于心肌梗死组(p<0.05),并且CD31染色提示在心肌梗死边缘区,细胞移植组的血管密度明显高于心肌梗死组(p<0.05)。结论：将人心脏成纤维细胞重编程的iPSCs分化的心肌细胞移植到心肌梗死小鼠心脏表面,4周后发现大量心肌细胞在小鼠体内存活并发育成熟,并且明显改善小鼠的心脏功能,减少了缺血区域心肌的凋亡并促进心肌梗死边缘区的血管生成。