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帕金森病(Parkinsons disease,PD)是一种多发于中老年期的中枢神经系统(central nervous system,CNS)退变性疾病,其主要病理特征为黑质致密部多巴胺能神经元进行性死亡,导致纹状体多巴胺(Dopamine,DA)含量下降。患者典型的临床症状为静止性震颤、肌僵直、运动迟缓和姿势平衡障碍等。
PD的病因和发病机制目前尚不清楚,以DA氧化代谢为核心的氧化应激和老化相关的抗氧化系统缺陷可能是多种致病因素导致PD患者黑质DA能神经元选择性死亡的共同通路,动物实验和临床研究发现某些抗氧化药物可能对DA能神经元具有保护作用。褐藻多糖硫酸酯(fucoidan)是褐藻来源的天然硫酸多糖,其主要成分为结合有硫酸基的岩藻糖,已经发现它具有抗凝、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒和免疫调节等多种生物活性。近期研究表明,褐藻多糖硫酸酯可以抑制脑出血模型大鼠脑内的炎症反应,减少缺血缺氧脑病模型大鼠的脑梗死面积以及对抗β淀粉样蛋白诱导的基底前脑胆碱能神经元的损伤。褐藻多糖硫酸酯对DA能神经元是否具有神经保护作用,其作用机制如何?国内外尚未见报道。本工作从离体和整体两个方面,就海带褐藻多糖硫酸酯的中枢药理活性及神经保护机制进行了初步的实验观察与分析。
1.离体实验以神经毒素6-羟基多巴胺(6-Hydroxydopamine,6-OHDA)和1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-Methyl-4-phenylpyridinium,MPP+)为工具药分别处理MN9D细胞,建立两种PD细胞损伤模型。用不同浓度的褐藻多糖硫酸酯与6-OHDA或MPP+作用的MN9D细胞共孵育,观察褐藻多糖硫酸酯对6-OHDA或MPP+所致MN9D细胞毒性作用的影响,发现：
1.1.不同浓度的6-OHDA或MPP+分别孵育MN9D细胞12h～48h,可以诱发细胞损伤,MTT法检测细胞活力下降,细胞培养液上清中乳酸脱氢酶(1actate dehydrogenase,LDH)释放量增加,其毒性作用呈现一定的剂量依赖性和时间依赖性；50μM6-OHDA作用24h或50μM MPP+作用36h的损伤效应适于进行保护性药物筛选；
1.2.不同浓度的褐藻多糖硫酸酯孵育MN9D细胞24h和48h,用MTT法检测细胞活力,发现0.001～10 mg/ml褐藻多糖硫酸酯孵育24h不影响细胞活力,高浓度即1 mg/ml和10 mg/ml褐藻多糖硫酸酯孵育48 h可以提高细胞活力；
1.3.0.01～1mg/ml褐藻多糖硫酸酯预孵育MN9D细胞1h,再加入50μM6-OHDA或50μM MPP+共同孵育MN9D细胞24h或36h,褐藻多糖硫酸酯可以拮抗6-OHDA或MPP+诱导的MN9D细胞活力下降和LDH释放增加,并具有剂量依赖效应；
1.4.50μM6-OHDA或50μM MPP+分别孵育MN9D细胞8h或12h,用二氯荧光素乙二酯(27-dichlorofluorescin diacetate,DCF-DA)检测发现MN9D细胞内氧化应激水平明显增强,0.01～1 mg/ml褐藻多糖硫酸酯预孵育MN9D细胞1h可以减轻6-OHDA或MPP+所致的细胞内氧化应激水平增强。
2.整体实验:
以1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)为工具药建立PD小鼠模型。褐藻多糖硫酸酯(12.5mg/kg和25 mg/kg)腹腔注射(i.p.)给药,每天1次,第11d给药1h后给予MPTP-HCL(15 mg/kg,i.p.,连续4次,每次间隔2h),继续褐藻多糖硫酸酯治疗,分别在末次注射MPTP之后2h、24h和7d观察其对MPTP小鼠纹状体MPP+含量、黑质氧化应激水平和行为学、纹状体DA及其代谢产物的含量、黑质DA能神经元数量以及黑质纹状体酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)蛋白表达的影响；改变给药途径,观察褐藻多糖硫酸酯(50 mg/kg和100mg/kg)灌胃(i.g.)对MPTP小鼠行为学和纹状体DA含量的影响。发现：
2.1.应用Truscan2.0动物活动监测系统记录60 min内小鼠的自主活动情况,发现褐藻多糖硫酸酯(25 mg/kg,i.p.)可显著提高MPTP小鼠的总活动距离、平均活动速度和每次活动的平均移动距离,提示褐藻多糖硫酸酯可以明显改善MPTP小鼠的自主活动减少；
2.2.高效液相-电化学检测法(high performance liquid chromatographyelectrochemical detection,HPLC-ECD)检测纹状体DA及其代谢物含量,发现褐藻多糖硫酸酯(12.5 mg/kg和25 mg/kg,i.p.)可以提高MPTP小鼠纹状体DA及其代谢产物3,4-二羟基苯乙酸(3,4-dihydroxy phenylaceticacid,DOPAC)的含量(4134.20±430.16 ng/g,5407.55±554.94 ng/gvs.1677.55±167.04 ng/g和358.93±33.56 ng/g,422.30±39.23 ng/g vs.199.57±21.75 ng/g,p＜0.05,p＜0.01),逆转(DOPAC+HVA)/DA的异常增高,降低DA的代谢更新率；
2.3.用TH免疫组化染色方法观察了黑质DA能神经元的数目,结果显示,褐藻多糖硫酸酯(25 mg/kg,i.p.)处理后,MPTP小鼠黑质致密部TH阳性神经元数量由生理盐水(NS)对照组的37.6％升至56.6％(p＜0.05),与尼氏(Nissl)染色结果一致；
2.4.Western蛋白免疫印迹法检测MPTP小鼠纹状体和中脑黑质TH蛋白表达情况,发现褐藻多糖硫酸酯(25 mg/kg,i.p.)可以有效对抗MPTP所致小鼠纹状体和中脑黑质TH蛋白表达减少(p＜0.05)；
2.5.高效液相-紫外检测法(high performance liquid chromatography-ultravioletdetection,HPLC-UVD)检测纹状体MPP+含量,发现给予MPTP后2h小鼠纹状体MPP+含量与褐藻多糖硫酸酯(25 mg/kg,i.p.)预处理11d的小鼠没有明显区别(6.60±0.83 ng/mg vs.6.46±0.90 ng/mg)：
2.6.生化方法检测黑质脂质过氧化产物丙二醛(malonaldialdehyde,MDA)的含量,结果显示：腹腔注射MPTP后24h,黑质MDA含量明显升高。褐藻多糖硫酸酯(12.5 mg/kg和25 mg/kg,i.p.)处理后,MPTP小鼠黑质MDA含量由NS对照组的141.08％分别降至96.88％和81.7％,具有统计学意义(p＜0.05,P＜0.01);
2.7.生化方法检测黑质抗氧化系统的活性,发现腹腔注射MPTP后24h,黑质谷胱苷肽(glutathione,GSH)含量、超氧化物岐化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱苷肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-px)、过氧化氢酶(catalase,CAT)活性和总抗氧化能力(total antioxidant capacity,TAOC)均低于NS对照组；褐藻多糖硫酸酯(25 mg/kg,i.p.)处理可使上述指标显著改善(p＜0.05,p＜0.01)；
2.8.组织病理学苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色结果表明治疗剂量的褐藻多糖硫酸酯(25 mg/kg,i.p.)对正常小鼠和MPTP小鼠的肝脏、肾脏、睾丸的组织形态学无明显影响；
2.9.褐藻多糖硫酸酯(50 mg/kg和100 mg/kg,i.g.)同样可以改善MPTP小鼠的自主活动减少和提高纹状体DA及DOPAC的含量,降低DA的代谢更新率。
3.结论:
3.1.首次在离体和整体PD模型中证实了海带褐藻多糖硫酸酯对DA能神经元具有神经保护作用；
3.2.离体和整体实验均证明褐藻多糖硫酸酯的抗氧化活性参与了其神经保护作用,作用机制可能为清除自由基、抑制脂质过氧化和提高抗氧化系统的活性；
3.3.治疗剂量的褐藻多糖硫酸酯具有良好的安全性；
3.4.本研究显示天然海洋药物褐藻多糖硫酸酯对PD实验模型的DA能神经元具有明确的保护作用,沿这一方向继续深入研究可能会开发出具有中国自主知识产权的神经保护药物,为防治PD等神经退行性疾病提供新的思路。