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目的:多发性硬化(MS)是一种以中枢神经系统脱髓鞘病变为主的自身免疫病。目前尚无根治方法。人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)和人羊膜上皮细胞(hAECs)具有免疫调节作用,为治疗MS提供了可能。本研究以大鼠实验性自身免疫性脑脊髓(EAE)作为MS的模型,观察hAMSCs和hAECs的治疗效应和免疫调节作用。
方法:①采用胰酶-胶原酶两步消化法分离培养hAMSCs、hAECs细胞,用流式细胞术(FCM)和免疫组化进行鉴定。②采用豚鼠脊髓匀浆+完全弗氏佐剂(CFA)+百日咳毒素(PTx)复制EAE大鼠模型。成模动物随机分为模型组(n=12)、培养基组(n＝6)、hAMSCs治疗组(n=12)、hAECs治疗组(n=12)和泼尼松治疗组(n＝12)。另设正常组(n=6)作为平行对照。细胞治疗组经双侧侧脑室注射hAMSCs或hAECs悬液10μl/只（含5×105个细胞）,培养基组同样的途径注射等体积无血清的L-DMEM培养基,药物治疗组腹腔注射泼尼松25mg/(kg.d)连续一周。③动态观察动物体重变化,采用kono评分观察行为学改变。④HE染色观察大鼠脑和脊髓组织病理改变。⑤细胞移植后3周和5周,免疫荧光染色示踪供体细胞在脑和脊髓组织内的分布。⑥细胞移植后3周和5周,流式细胞术(FCM)检测大鼠外周血Th1、Th2、Th17、Treg、Tc1和Tc2 T淋巴细胞亚群变化。⑦流式微球芯片捕获技术(CBA)检测血浆细胞因子IFN-γ、 TNF-α、IL-2、IL-4和IL-10的含量。
结果:①第3代hAMSCs表达CD44、CD73、CD90、CD105及波形蛋白阳性,不表达CD14、CD19、CD34、CD45、CD80、CD86和HLA-DR;第三代hAECs表达CD29、CD44、CD73及CK19阳性,不表达CD34、CD45、CD71、CD80、CD86和HLA-DR。②hAMSCs和hAECs治疗组分别于移植后第5天和第3天开始至观察期结束,kono评分均明显低于模型组和培养基组(P＜0.05; P＜0.01);第20天至第35天,hAECs组kono评分明显低于hAMSCs组(P＜0.05;P＜0.01);第14天至第35天,hAECs组kono评分明显低于泼尼松组(P＜0.05; P＜0.01)。③与正常组大鼠比较,各组大鼠体重不同程度下降,但hAMSCs和hAECs治疗组从移植后9天起,动物体重止降启稳,至第5周渐增至移植时体重水平,且明显高于模型组、培养基组和泼尼松组（均P＜0.05）。④病理检查可见hAMSCs和hAECs治疗组脑和脊髓炎性细胞浸润明显减轻。⑤免疫荧光染色结果显示,hAMSCs组和hAECs组移植后3周和5周,脑和脊髓组织中均有较多人细胞核抗原阳性即hAMSCs和hAECs存活。⑥FCM分析结果显示,与模型组比较, hAMSCs治疗组、hAECs治疗组和泼尼松组Th2、Tc1（CD4-CD8+IFN-γ+）、Tc2(CD4-CD8+IL-4+)和Treg细胞百分率均明显升高（P＜0.05; P＜0.01）,而Th17显著下降(均P＜0.01),Th1/Th2和Th17/Treg比值均降低(P＜0.05;P＜0.01);hAMSCs组和hAECs组比较,后者Th1细胞下降和Treg细胞升高更为显著(P＜0.05); hAMSCs组和hAECs组与泼尼松组比较, Th17细胞下降更明显(P＜0.01; P＜0.05)。⑦CBA法检测结果显示,与模型组比较,hAMSCs和hAECs治疗组第3周和第5周IL-2和IFN-γ含量均明显降低(P＜0.05;P＜0.01),IL-4和IL-10均显著升高（P＜0.05;P＜0.01）;与泼尼松组比较,第3周和第5周hAMSCs和hAECs组IL-2的含量均明显降低（均P＜0.05）,第5周IL-10含量明显升高(P＜0.05),第5周hAECs组TNF-α明显减少;hAECs组第5周TNF-α的含量明显低于hAMSCs组(P＜0.05)。
结论:hAMSCs和hAECs移植能明显改善EAE大鼠神经功能,其机制可能主要与调节淋巴细胞亚群,尤其与上调FoxP3+Treg和下调Th17有关,提示hAMSCs和hAECs作为临床MS的免疫调节治疗具有潜在应用价值。