血蓝蛋白是存在于节肢动物和软体动物血淋巴中的含铜呼吸蛋白,近年来研究表明,血蓝蛋白是一种具有多种免疫学活性的多功能蛋白。然而迄今为止,其启动子的序列、结构等尚不清楚。为此,本研究采用现代分子生物学策略,对其进行了较为深入、系统的研究,所获主要研究结果如下:　　1、血蓝蛋白大亚基启动子序列的克隆　　首先,采用染色体步移技术克隆凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)血蓝蛋白大亚基(命名为HcL)部分5非翻译区序列,结果成功获得一条大小为949bp的条带(命名为p949)。　　继而,设计特异性引物对所得片段进行特异性扩增、测序分析,序列比对发现其与p949具有99％的相似性。　　最后,选用TFSEARCH软件对该序列进行生物信息学分析,结果显示,p949可能含有TATA-Box、HSF、Dfd、CF-Ⅱ等顺式作用元件。　　由此提示,p949应该含有凡纳滨对虾血蓝蛋白大亚基启动子序列。　　2、HcL启动子活性的检测及其核心启动子区、位点的确定　　首先,运用基因克隆技术将p949与表达载体pGL3-Basic相连,并将重组表达载体(pGL3-p949)转染果蝇S2细胞,采用萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒检测其转录活性。结果发现,实验组报告基因活性为阴性对照组的1.49倍(p<0.001)。由此说明,所获得的序列具有一定的启动子活性。　　然后,基于MEME软件、BDGP-promoter软件分析结果,采用PCR定向亚克隆策略,构建4个覆盖p949序列的缺失片段,将其分别命名为D1(缺失-267～-40)、D2(缺失-267～+11)、D3(缺失-267～+243)、D4(缺失-267～+367)。荧光素酶报告基因检测活性发现,D1至D4活性依次为阳性对照组的84.4%、82.6%、68.9%和69.3%,其中D3报告基因活性最低(p<0.001),提示p949中的“-267～+243”区域可能为血蓝蛋白大亚基核心启动子区。　　最后,运用BDGP-promoter软件预测核心启动子区的核心启动子位点,结果表明,在-267～+243区域含有Promoter1和Promoter2两个可能的核心启动子位点,其中-39～+10位点含有典型的TATA-Box核心元件。在此基础上,进一步采用重叠PCR技术对TATA-Box核心元件进行删除突变,并构建突变子pGL3-p949D。报告基因活性比对发现,pGL3-p949D突变子活性降低至阳性对照的73.9%(p<0.01)。由此提示,TATA-Box核心元件可能为p949发挥转录活性的核心启动子位点之一。　　综上所述,本研究主要获得凡纳滨对虾血蓝蛋白大亚基部分启动子序列,并对其核心启动子区、核心启动位点进行了较深入的探索。所获研究结果为阐明对虾血蓝蛋白的基因转录表达调控机制,揭示对虾免疫防御机制等提供了良好的科学依据,对丰富对虾免疫学研究具有一定的理论意义与潜在的应用价值。