慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）具有发病率逐年增高、治疗手段有限、转归预后差、医疗费用昂贵等特点,已成为全球范围内的公共健康问题。2012年对我国成年人进行的一项大型横断面研究结果显示CKD发病率为10.8%,累及大概1.19亿人群^[1]。而流行性病学研究表明急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）是CKD的独立危险因素,急性肾损伤的程度、发生频率及持续时间都与CKD进展有关,AKI到CKD的转变是进展性肾功能恶化的重要病因。AKI到CKD转变是复杂的病理生理过程,目前研究包括肾小管细胞不完全再生（发生EMT和G2/M细胞周期停滞等）、持续慢性炎症反应（M1巨噬细胞表型转变为M2）、线粒体功能障碍、遗传学修饰（DNA甲基化和microRNA表达）、RAS激活、内皮细胞失功能和微血管稀疏等^[2]。肾小管上皮细胞是新陈代谢极度活跃细胞,对氧化还原反应失衡尤其敏感,大量研究表明肾小管上皮细胞氧化损伤在AKI、AKI-CKD以及CKD的发生发展中均具有重要作用^[3]。在体内维持氧化还原平衡的重要调节因子是核转录因子NF-E2相关因子2（Nuclear Factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2）,参与抗氧化、抗炎、解毒等反应。Nrf2信号通路是一个复杂、高度保守的病理生理反应,其经典调节反应为Keap1依赖的信号通路,生理状态下,Keap1与Nrf2的结合,以复合体的形式被锚定在胞浆肌动蛋白骨架上,使Nrf2在胞质中稳定表达,并处于低浓度的非活性状态,而在氧化应激状态下,Nrf2与Keap1解离,被激活后进入细胞核内,识别抗氧化反应元件的DNA序列并结合,启动抗氧化基因的表达,发挥细胞保护作用。而Nrf2非经典调节反应,也就是不依赖Keap1的信号通路中,糖原合成酶激酶3β（Glycogen synthase kinase 3β,GSK3β）被认为是多种Nrf2诱导剂的“共同效应器”,是细胞受刺激后延迟阶段对Nrf2调控的主要机制。GSK3β是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,广泛表达于体内多种器官,在衰老、2型糖尿病、神经性病变、肝脏疾病等多种疾病中GSK3β均参与调控Nrf2^[4]。但是在AKI到CKD的转变中,GSK3β是否参与调控Nrf2介导的抗氧化反应?目前还未见报道。因此,在本研究中利用叶酸诱导的肾脏损伤模型、过氧化氢诱导的细胞氧化损伤模型和患者肾穿刺标本,使用条件性基因敲除小鼠和GSK3β抑制剂氯化锂干预手段,从患者组织、动物、细胞三个方面,全面探讨GSK3β通过调节Nrf2介导的抗氧化反应,参与AKI到CKD转变的作用机制。第一部分:叶酸诱导的小鼠肾损伤模型及患者肾穿刺活检标本中,肾小管上皮细胞持续活化的GSK3β与Nrf2抗氧化反应受损,参与AKI到CKD转变目的利用叶酸诱导的小鼠肾损伤模型及患者肾穿刺活检标本,观察肾小管上皮细胞中GSK3β的表达和Nrf2介导的抗氧化反应,明确其在AKI到CKD转变中的作用。方法1.利用叶酸诱导的肾损伤回顾性分析模型,根据损伤第28天小鼠血肌酐中位值分为高肌酐组和低肌酐组,回顾性分析各组不同时间点的血肌酐变化,观察损伤第28天肾脏的形态和肾重比变化,Masson染色观察肾脏病理改变,western blot、免疫组化染色方法检测Fibronectin、8-OHdG、p-Histone H3等蛋白表达变化。2.利用叶酸诱导的肾损伤前瞻分析模型,在叶酸损伤第3天进行血肌酐筛选,根据第7、14和28天血肌酐中位值分别分为高肌酐组和低肌酐组,Masson染色观察肾脏病理改变,免疫组化染色检测观察8-OHdG、GSK3β、Nrf2、HO-1的变化,western blot检测GSK3β、p-GSK3β（S9）、Nrf2、HO-1、Keap1、Fibronectin、α-SMA、Collagen I、Lipocalin-2、Nitrotyrosine蛋白的表达变化,定量分析GSK3β、1-p-GSK3β（S9）/GSK3β的蛋白表达水平变化。3.选择正常对照、AKI完全恢复疾病对照（正常移植肾）、不同病因导致的CKD患者肾脏穿刺活检标本,免疫组化染色观察8-OHdG、GSK3β、Nrf2、HO-1的变化。结果1.在叶酸诱导的肾损伤回顾性分析模型中,损伤第28天高肌酐组和低肌酐组血肌酐有统计学差异（P<0.05）。与低肌酐组相比,高肌酐组肾脏表面凹凸不平,体积缩小,肾重体重比下降,差异有统计学差异（P<0.01）;Masson染色结果显示高肌酐组胶原纤维增多,Collagen I的蛋白表达水平也升高,纤维化指标Fibronectin的免疫荧光和western blot结果均显示其蛋白表达水平增多,G2/M细胞周期停滞指标p-Histone H3的表达在高肌酐组增多,氧化应激损伤指标8-OHdG阳性表达和Nitrotyrosine蛋白表达升高。2.在叶酸诱导的肾损伤前瞻性分析模型中,高肌酐组和低肌酐组血肌酐在第14天开始出现统计学差异（P<0.05）,半定量形态分析也表明两组之间的肾脏组织学变化直到第14天才具有统计学差异。而且,8-OHdG免疫组化染色结果显示:在损伤第3天,肾小管中8-OHdG阳性表达达到峰值,随之低肌酐组表达进行下降,高肌酐组持续高表达,氧化损伤较重,形态学分析结果显示第7天两组出现统计学差异（P<0.05）,这与Lipocalin-2、Nitrotyrosine蛋白变化趋势一致。3.在叶酸诱导的肾损伤前瞻性分析模型中,免疫组化染色结果显示损伤第3天,肾小管中的Nrf2表达显著增多,并且主要表达于细胞核中,表明Nrf2被激活;下游蛋白HO-1在肾小管中的表达也升高。低肌酐组肾小管Nrf2核表达和HO-1持续存在,核蛋白Nrf2和总蛋白HO-1的western blot结果也有同样发现,而且Keap1的western blot结果发现两组间表达差异不明显,说明Nrf2的表达变化与Keap1无明显相关。GSK3β免疫组化染色结果显示,正常状态和损伤急性期,肾小管中GSK3β的表达较低,进入慢性期后,与低肌酐组相比,高肌酐组肾小管中GSK3β的表达持续升高。肾组织匀浆western blot及定量分析结果显示p-GSK3β（S9）的表达在急性期急剧减少,随后低肌酐组的表达逐渐恢复,高肌酐持续低表达;1-p-GSK3β（S9）/GSK3β代表GSK3β的活性,分析结果表明与低肌酐组相比,高肌酐组GSK3β活性持续增强,低肌酐组GSK3β活性逐渐回落。4.在患者肾组织标本中,8-OHdG免疫组化染色显示:与正常对照组相比,正常移植肾组表达可见,而CKD患者的表达显著增多,表明CKD组氧化应激损伤严重。各标本连续切片染色发现,在同一肾小管中Nrf2的活性与GSK3β的表达变化相关,正常状态下,GSK3β在肾小管中的表达较少,Nrf2主要在胞浆中表达,HO-1蛋白表达少;CKD患者肾小管中Nrf2核聚集和HO-1表达减弱,与此同时同一肾小管中GSK3β的表达明显增多。结论1.叶酸诱导的小鼠急性肾损伤长期预后取决于肾小管氧化损伤的程度。2.在叶酸诱导的肾损伤小鼠中,AKI到CKD的转变与肾小管持续氧化损伤相关。3.在叶酸诱导的小鼠AKI到CKD转变中,Nrf2抗氧化反应受损与肾小管上皮细胞GSK3β持续过活化有关。4.在AKI到CKD转变的患者肾组织中,肾小管中GSK3β过表达与Nrf2介导的抗氧化反应受损共同存在。第二部分:在过氧化氢诱导的肾小管上皮细胞氧化应激模型中,靶向抑制GSK3β对Nrf2活性及细胞功能的影响目的有研究显示GSK3β可通过直接或间接作用调节Nrf2的核转运,因此为了进一步探索肾小管上皮细胞中GSK3β过活化与Nrf2抗氧化反应受损是否存在因果关系,以及GSK3β对细胞凋亡、转分化、G2/M细胞周期停滞等功能的影响。方法选用TKPT细胞株,利用脂质体2000转染EV（空质粒pcDNA3.1）、GSK3βS9A（GSK3β持续激活）质粒、GSK3βKD（GSK3β失活）质粒,联合给予终浓度为200μmol/L过氧化氢刺激48小时。1.Nrf2与DAPI免疫荧光共染观察Nrf2的核表达变化。2.细胞TUNEL染色了解细胞凋亡,E-Cadherin与Vimentin免疫双荧光染色明确细胞转分化功能变化,p-Histone H3荧光染色了解G2/M细胞周期停滞。3.提取各组细胞总蛋白和核蛋白,western blot检测核蛋白中Nrf2和Histone的表达,检测总蛋白中HO-1、Keap1、HA、GSK3β、Collagen I、E-Cadherin、Vimentin、Cleaved Caspase 3和p-Histone H3的蛋白表达水平。结果1.HA免疫荧光染色和western blot结果显示GSK3βS9A和GSK3βKD质粒在肾小管上皮细胞中的转染效果满意。2.免疫荧光染色结果显示EV组Nrf2主要表达于肾小管上皮细胞的胞浆中,过氧化氢损伤后,Nrf2核表达明显增多,western blot结果也显示Nrf2核蛋白表达增多,HO-1蛋白表达增强。过氧化氢刺激后,与EV组相比,转染GSK3βKD质粒的细胞Nrf2核表达增强,而GSK3βS9A质粒组Nrf2的核表达减少。GSK3βS9A和KD质粒转染后Keap1的表达无明显变化。3.免疫荧光显示过氧化氢刺激后,EV组TUNEL及p-Histone H3阳性细胞均增多,western blot结果显示Cleaved Caspase 3和p-Histone H3蛋白表达水平升高;细胞转分化指标E-Cadherin的表达下降,Vimetin蛋白表达增多;细胞外基质Collagen I的表达水平升高。GSK3βS9A质粒转染可加剧过氧化氢诱导的细胞凋亡、促进细胞转分化及增加细胞外基质合成;GSK3βKD质粒转染的细胞可减轻上述细胞损伤。结论在肾小管上皮细胞,过氧化氢刺激后,GSK3β通过调控Nrf2的核表达及抗氧化反应,影响细胞凋亡、转分化、细胞周期等功能,而且是非Keap1依赖的。第三部分:在叶酸诱导的小鼠肾损伤模型中,GSK3β基因敲除和氯化锂对Nrf2活性及AKI到CKD转变的影响目的在叶酸诱导的肾损伤模型中,条件性基因敲除和氯化锂治疗后,观察是否影响Nrf2的功能,是否对AKI的预后产生积极影响,进一步验证GSK3β调控Nrf2的抗氧化反应是否可作为预防AKI进展为CKD的有效药物治疗靶点。方法1.利用Cre/loxp技术构建条件性GSK3β基因敲除小鼠。PCR和免疫组化方法检测肾小管中GSK3β是否敲除成功。2.利用条件性GSK3β基因敲除小鼠,通过大剂量（300mg/kg）腹腔注射叶酸建立肾损伤模型,分为KO组和Con两组。损伤第3、7、14和28天检测血肌酐。PAS染色观察各组小鼠肾脏病理改变。3.利用基因敲除小鼠建立的叶酸肾损伤模型,免疫组化染色观察损伤第28天KO组和Con组Nrf2、HO-1、8-OHdG的表达,免疫荧光染色观察E-Cadherin、Vimentin表达;肾组织匀浆提取核蛋白检测Nrf2的表达变化;提取总蛋白检测Keap1、HO-1、Lipocalin-2、Nitrotyrosine、Fibronectin、E-Cadherin、Vimentin蛋白表达水平变化。4.在叶酸诱导的肾损伤模型中,在损伤第7天随机给予皮下注射40mg/kg小剂量氯化锂治疗一次,在氯化锂治疗的第0、1、3、5、7天western blot方法检测肾脏中GSK3β和p-GSK3β（S9）蛋白的表达水平。5.在叶酸诱导的肾损伤模型中,损伤第7天随机分为氯化钠组、氯化锂组、氯化锂+Trig组。观察叶酸损伤第28天各组小鼠肾脏形态学变化。检测各组小鼠第0、3、7、14和28天血肌酐水平。Masson染色观察各组胶原变化,免疫组化染色检测Fibronectin、p-Histone H3、GSK3β、Nrf2、HO-1、Nitrotyrosine的表达,免疫荧光染色观察E-Cadherin、Vimentin的表达变化。肾脏匀浆核蛋白western blot检测Nrf2核表达的变化,总蛋白western blot检测Fibronectin、Collagen I、p-Histone H3、E-Cadherin、Vimentin、GSK3β、p-GSK3β、HO-1、Nitrotyrosine蛋白表达变化。结果1.PCR凝胶结果显示条件性基因敲除小鼠同时表达Cre基因和floxed-GSK3β基因。GSK3β免疫组化染色显示KO组小鼠肾小管中GSK3β的表达选择性缺失,肾小球中GSK3β的表达与Con组无差异。2.叶酸损伤第28天,与Con组相比,KO组肌酐显著下降,差异有统计学差异（P<0.05）;PAS染色及半定量肾脏损伤指数分析显示,与Con组相比,KO组肾脏纤维化、肾小管萎缩病变减轻,且差异有统计学意义（P<0.05）。3.与Con相比,KO组Nrf2抗氧化反应显著增强,表现为Nrf2核表达增多,HO-1表达增多,与此一致的是,肾小管细胞中以8-OHdG为代表的氧化损伤减轻。Western blot结果也发现,与Con组相比,叶酸损伤后第7天KO组Nrf2核聚集明显增多。Nitrotysorin和Lipocalin-2的表达在KO组减少,与此同时,细胞外基质如Fibronectin的沉积也减轻。4.叶酸损伤第7天给予皮下注射40mg/Kg氯化锂治疗一次,锂治疗导致p-GSK3β（S9）的表达明显减少,因此,建立了每周一次小剂量氯化锂皮下注射的治疗方案。5.在损伤第28天,与氯化钠组相比,延迟氯化锂治疗组血肌酐下降,肾脏形态好转,Masson染色胶原沉积较少,Collagen I蛋白表达减少,纤维化指标Fibronectin及G2/M细胞周期停滞p-Histone H3免疫组化染色和western blot结果显示表达均减少,细胞分化指标E-Cadherin表达增多、Vimentin表达减少。免疫组化和western blot结果显示氯化锂治疗组GSK3β表达减少,p-GSK3β（S9）蛋白表达增多,Nrf2的核表达增多,HO-1的蛋白表达增多,Nitrotyrosine的表达减少,但是同时加用Trig治疗（Nrf2的小分子抑制剂）,氯化锂的上述作用可被Trig所拮抗。结论1.在叶酸诱导的肾损伤模型中,条件性敲除肾小管中GSK3β,增强Nrf2的抗氧化反应,延缓AKI到CKD的转变,而且是不依赖Keap1的。2.在叶酸诱导的肾损伤模型中,延迟每周一次小剂量氯化锂治疗能有效抑制GSK3β的活性。3.在叶酸诱导的肾损伤模型中,延迟小剂量氯化锂治疗增强Nrf2的抗氧化反应,改善急性肾损伤的长期预后,是预防AKI到CKD转变的有效药物。