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研究背景骨肉瘤(osteosarcoma)是一种侵袭性的恶性肿瘤,从间质细胞系发展而来,具有成骨细胞分化的特点,且极易发生肺转移,同时它也是儿童癌症中生存率较低的肿瘤之一,患者的五年生存率仅为65%-70%,严重威胁着青少年的健康。近年来在基因分子的水平对疾病进行研究越来越受关注,因此从基因分子水平上研究骨肉瘤的发病机制及防治,对其未来的诊断和治疗有更积极的作用。肿瘤转移相关基因(metastasis associated gene 1,MTA1)是核小体重塑和组蛋白去乙酰化酶复合物(Nucleosome remodeling and histone deacetylase,NuRD)的重要组成部分。大量的研究发现MTA1在多种肿瘤中高表达,并促进肿瘤的恶化,参与肿瘤的增殖、侵袭、迁移、凋亡和细胞周期等过程。有研究报道miR-183在骨肉瘤细胞系MG63、U2-OS、Saos-2和HOS中均异常低表达,并能靶向埃兹基因(Ezrin,其蛋白又称细胞骨架结合蛋白)抑制MG63细胞的侵袭和迁移,多种生物信息学软件预测显示miR-183可能与MTA1存在靶向结合区。因此,探讨miR-183靶向调控MTA1基因,对骨肉瘤增殖、侵袭、迁移及凋亡的影响,将为骨肉瘤发病机制研究及临床防治提供新的思路和方向。miR-183靶向调控MTA1基因对骨肉瘤细胞的影响及其分子作用机制的研究尚未见报道。研究目的本研究将通过实验验证MTA1是miR-183的直接靶基因,转染miR-183mimic至骨肉瘤细胞系MG63,观察miR-183对MTA1的靶向调控作用,及对MG63细胞增殖、侵袭、迁移与凋亡的影响,由此寻找骨肉瘤研究及防治新的靶点和策略。研究方法1.收集标本:自2014年9月至2016年6月从郑州大学第一附属医院收集了25例骨肉瘤患者的癌组织及与其配对的癌旁组织,并置于-80℃冰箱中长期保存。采用实时荧光定量PCR技术检测已收集标本中miR-183及MTA1基因的mRNA表达水平,并通过免疫印迹Western blot检测MTA1蛋白的表达并分析结果。2.采用TargetScan和miRanda等生物信息学软件预测靶向MTA1的microRNA。3.构建含有MTA1 3’端非翻译区域(3’UTR)的野生型和突变型载体,运用双荧光素酶报告基因实验验证MTA1与miR-183的靶向作用。4.RT-qPCR法检测正常成骨细胞株hFOB1.19与人骨肉瘤细胞系MG63中miR-183与MTA1基因的mRNA表达水平。5.体外合成miR-183 mimic和miR-183 negative control,采用脂质体将其分别转染到各组人骨肉瘤细胞系MG63中。实验分为3组,miR-183 mimic组:转染miR-183 mimic;NC组:转染miR-183 negative control;Control组:仅加脂质体。6.CCK-8实验检测骨肉瘤细胞系MG63的增殖情况。7.细胞划痕实验检测骨肉瘤细胞系MG63迁移能力改变情况。8.Transwell实验检测骨肉瘤细胞系MG63侵袭能力改变的情况。9.流式细胞术及TUNEL实验检测骨肉瘤细胞系MG63凋亡的情况。10.免疫印迹Western blot法检测转染后MTA1蛋白的表达。实验结果1.RT-qPCR检测结果显示,骨肉瘤组织中miR-183的表达量显著低于其在癌旁组织中的表达(P<0.01),而MTA1基因的mRNA在骨肉瘤中的表达量明显高于其在癌旁组织中的表达(P<0.01)。Western blot的结果显示,与癌旁组织比较,MTA1蛋白在癌组织中呈现高表达。2.双荧光素酶报告基因实验证明miR-183与MTA1基因的3’UTR区域结合,与生物信息学软件预测结果一致,表明MTA1是miR-183的靶基因。3.RT-qPCR结果显示,在骨肉瘤细胞系MG63中miR-183的表达显著低于成骨细胞株hFOB1.19中的表达(P<0.01),而MTA1基因的mRNA表达则明显高于其在成骨细胞株hFOB1.19中的表达(P<0.01)。4.转染后,miR-183 mimic组的miR-183表达量明显高于NC组与Control组,差异具有统计学意义(P<0.01)。表明miR-183 mimic转染骨肉瘤细胞成功。5.CCK-8结果显示,与NC组和Control组比较,转染miR-183 mimic组的骨肉瘤细胞在相同时间点的OD490吸光值有所下降,差异具有统计学意义(P<0.05),而NC组与Control组比较则无显著差异(P>0.05)。6.划痕实验结果显示,miR-183组细胞的迁移能力较NC组与Control组低,而NC组与Control组比较则迁移能力无明显差异。7.Transwell实验结果表明,miR-183组的骨肉瘤MG63细胞穿过基底膜的细胞数明显低于NC组与Control组,差异具有统计学意义(P<0.01),但NC组与Control组穿过基底膜的细胞数量无明显差异(P>0.05)。8.流式细胞术与TUNEL实验结果显示,与NC组和Control组比较,miR-183组的骨肉瘤MG63细胞的凋亡率明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05),而NC组与Control组比较,MG63细胞的凋亡率无显著差异(P>0.05)。9.免疫印迹Western blot检测结果显示,转染miR-183 mimic后,与NC组和Control组比较,MTA1蛋白表达下降,而NC组与Control组比较,MTA1表达无显著差异。结论1.骨肉瘤组织与细胞系MG63中miR-183低表达,MTA1高表达。2.miR-183可以通过靶向作用MTA1基因的3’UTR区域降低其转录表达,并发挥调控作用。3.过表达miR-183可能通过降低靶基因MTA1表达而有效抑制骨肉瘤细胞系MG63的增殖、侵袭、迁移并促进其细胞凋亡。