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背景与目的干细胞移植治疗是目前组织再生、损伤修复的重要策略,具有巨大的应用前景。干细胞的标记和成像在干细胞移植研究中具有重要的意义,可为明确干细胞的在体分布、迁移以及作用机制提供有力的支持。光学成像由于具有操作简便、灵敏度高、可实时成像和无放射性污染等优点已逐渐在干细胞标记和成像研究中得到重视。这一技术基于体外以荧光探针进行细胞标记,经光学成像观察移植细胞的在体分布和迁移情况。近红外荧光探针由于具有较深的组织穿透距离以及较弱的组织自发荧光干扰,使得在一定深度的组织内可获得较好的近红外荧光信号。本课题通过系统研究近红外荧光探针IR-780碘化物的光学以及生物学特性,并首次将其应用于生物学研究,评估其在活体荧光成像以及干细胞标记和活体示踪中的应用前景。研究方法第一部分,应用Kodak活体成像系统及荧光分光光度计检测IR-780碘化物的光学特性和在血清中的光稳定性。以0.2mg/kg剂量静脉注射IR-780碘化物,通过Kodak活体成像系统观察其在小鼠体内的组织分布及药代动力学情况。以2mg/kg剂量进行小鼠腹腔静脉注射IR-780碘化物,分别记录小鼠一般情况、体重变化,于注射后第7天进行血生化以及各器官组织学观察,初步评估IR-780碘化物在小鼠体内的急性毒性作用。第二部分,观察IR-780碘化物应用于活体成像的可行性。首先以0.5nmol和10nmol剂量IR-780碘化物皮下注射以示踪小鼠和猪局部引流的淋巴系统,进行活体淋巴系统成像,观察IR-780碘化物的荧光强度和局部储留时间。分别以近红外荧光探针吲哚菁绿和近红外荧光量子点作为阳性对照探针,比较三种材料在小鼠淋巴结成像中的荧光特性。同时,分别以IR-780碘化物和吲哚菁绿(Indocyanine green,ICG)按0.5mg/kg剂量经兔耳缘静脉注射,经眼底血管荧光造影比较二者血管造影中的荧光强度和成像时间。第三部分,以大鼠真皮多能干细胞作为被标记细胞,观察不同标记时间、标记浓度对细胞的荧光强度和活性的影响,确定最佳标记条件。共聚焦显微镜和流式细胞仪检测IR-780碘化物的细胞内定位、标记效率和对细胞周期的影响。分别以有机阴离子转运多肽(Organic anion-transporting polypeptide,OATP)特异性拮抗剂四溴酚酞磺酸钠(Sulfobromophthalein,BSP)和冰浴细胞等方法观察对细胞标记的影响。对正常细胞和标记细胞进行成脂、成骨和成肌定向诱导培养,观察IR-780碘化物标记对干细胞的多向分化潜能影响。以划痕法和克隆培养法观察IR-780碘化物标记对干细胞的迁移能力和克隆形成能力的影响。分别以与IR-780碘化物具有相似结构的近红外荧光探针ICG和IR-786作为对照,比较三种干细胞标记探针的标记效率和标记荧光强度。以IR-780碘化物标记人骨髓间充质干细胞、大鼠骨髓间充质干细胞和GFP转基因小鼠骨髓间充质干细胞,观察其对不同干细胞种类的标记能力。第四部分,以IR-780碘化物标记真皮多能干细胞,以2×106/只尾静脉注射于大鼠体内,于不同时间点应用近红外活体成像系统观察移植细胞在大鼠体内的分布;应用共聚焦显微镜观察移植细胞在组织器官的分布情况;以超声细胞粉碎仪体外裂解标记细胞,经尾静脉注射于大鼠体内观察细胞裂解后IR-780碘化物在体内的分布和代谢情况;以血管扩张药物硝普钠预处理大鼠后,在以2×106/只尾静脉注射于大鼠体内,应用近红外活体成像系统观察血管扩张剂在促进移植细胞通过肺循环中的作用。研究结果本研究主要结果如下:1.近红外荧光探针IR-780碘化物具有优越的荧光特性,其荧光强度随不同溶剂而有所不同,以血清中最高,PBS中最低。与近红外荧光探针吲哚菁绿比较,在相同浓度下,IR-780碘化物与ICG在无水甲醇中具有相近的荧光强度,而在血清中IR-780碘化物的荧光强度显著高于ICG。IR-780碘化物在终浓度为1uM的血清溶液中,在37℃条件下荧光信号在1小时内未出现荧光减弱现象,具有较好的血清稳定性。经静脉注射IR-780碘化物后,主要分布于肝、肾、脾脏等器官,随时间而逐渐减弱。正常小鼠经一次性给予较高剂量IR-780碘化物,7天内未发现明显体重减轻等毒性反应,各血、生化指标正常,各组织器官无明显病理性改变。2.在淋巴系统成像中,经皮下注射后IR-780碘化物可沿注射局部淋巴管走形分布于引流的淋巴结处;经小鼠前爪皮下注射后,其臂淋巴结处可检测到明显荧光信号,并且荧光信号可持续3小时以上;与ICG和QDs比较,IR-780碘化物在淋巴系统成像中具有更强的荧光信号和更高的灵敏性。经淋巴结体外观察和组织学观察,可见荧光信号位于淋巴结外围淋巴窦内;经小鼠后爪和尾皮下注射后,IR-780碘化物可沿注射局部淋巴管分别分布于引流的腘窝淋巴结和坐骨淋巴结处,并可随淋巴引流至下一级淋巴结;经猪腹壁皮下注射后,可检测IR-780碘化物可沿注射局部淋巴管分布于相应淋巴结;淋巴结内IR-780碘化物所产生的荧光信号可在多聚甲醛固定情况下保持2周以上;在血管荧光造影实验中,经兔耳缘静脉注射后,与ICG对比,IR-780碘化物在眼底血管荧光成像中具有更高的荧光强度和更持久的成像时间,可清晰显示眼底血管形态。3. IR-780碘化物可成功标记多种干细胞。标记细胞荧光强度随标记时间增加而升高。标记时间15min,标记浓度20uM可获得最佳标记效果。与已应用于干细胞标记的传统近红外荧光探针ICG、IR-786比较,IR-780碘化物标记细胞具有更高的荧光强度和标记效率,标记后对细胞活性、周期、增殖和迁移能力无明显影响。标记的干细胞在体外仍具有向成脂细胞、成骨细胞和成肌细胞表型诱到分化的潜能。IR-780碘化物标记细胞的荧光信号主要分布在胞浆,定位于细胞线粒体内。冰浴和拮抗OATP均能降低标记效率。IR-780碘化物经免疫荧光染色后仍具有较好的荧光信号。4.在近红外荧光成像下可实时观察IR-780碘化物标记干细胞在移植体内的分布和代谢情况;可见静脉移植后细胞主要聚集于肺部。应用IR-780碘化物标记细胞,在近红外荧光成像下可监测静脉移植干细胞在肺部的通过情况,应用血管扩张剂硝普钠可明显增加静脉移植细胞的肺部通过率(p<0.05)。结论本课题研究中,我们通过系统研究近红外荧光探针IR-780碘化物的光学和生物学特性,并在此基础上将其首次作为荧光探针应用于生物学研究。重点研究IR-780碘化物对干细胞的体外标记以及活体示踪情况,探讨应用IR-780碘化物作为干细胞标记探针的可行性及临床应用前景。本课题取得的主要结论包括:1.近红外荧光探针IR-780碘化物具有优越的荧光特性、血清稳定性和生物相容性,可作为理想的近红外荧光探针应用于活体成像研究;2.近红外荧光探针IR-780碘化物可成功应用于大、小型动物的淋巴结成像、血管造影等研究。IR-780碘化物标记的组织在固定后仍可保持良好的光稳定性,有利于组织标本的保存、观察和多次评估。3.IR-780碘化物可成功标记干细胞并对干细胞多种生物学特性无明显影响;其标记效率及标记荧光强度明显高于传统近红外干细胞标记探针。4、近红外荧光成像下可实时观察IR-780碘化物标记干细胞在移植体内的分布和代谢情况,可用于监测静脉移植干细胞在肺部的通过情况。应用血管扩张剂硝普钠可明显增加静脉移植细胞的肺部通过率。