研究背景：目前肝癌临床常规治疗效果不佳，基因治疗的问世开辟了肝癌治疗的新途径。针对个别癌基因或个别抑癌基因治疗肝癌只能缓解肝癌发生过程中的某一步骤，并不能达到根治肝癌的目的。抑癌基因治疗是将正常的肿瘤抑制基因导入肿瘤细胞可代替和补偿缺陷的基因，以抑制肿瘤的生长，这是从根本攻克肿瘤的关键环节。p16和p53基因是与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因。利用基因转染技术将抑癌基因p16、p53转染至肿瘤细胞以感染肿瘤细胞，可以在多个环节上组织肝细胞增殖与癌变，达到抑制肿瘤生长的目的。而DNA进入细胞需选择适当的基因转运载体系统，纳米颗粒材料的选择是成功进行纳米基因转运和治疗的关键。聚丙交酯乙交酯(PLGA)是用于控制多种药物释放成功的载体之一，无毒、可以生物降解、生物相容，是较理想的纳米载体材料，目前研究较少。 第一章：构建p16与p53基因融合表达载体pcDNA16-53 目的：构建基因融合表达载体pcDNA16-53。 方法：将p16A质粒的酶切鉴定、PMAMneo53质粒和pcDNA3.1质粒分别进行酶切鉴定后，混合并加入T4连接酶和T4连接buffer，16℃混合12hr后可得pcDNA16-53，再行酶切鉴定证实。 结果：pcDNA16经酶切、补平后能与p53基因片段进行平端连接，连接后为pcDNA16-53，大小8.0kb，方向为正向插入。 第二章聚丙交酯乙交酯(PLGA)纳米粒的制备 目的：制备聚丙交酯乙交酯(PLGA)纳米粒。 方法：制备PLGA纳米粒，并测定其粒径和粒径分布、浊点、包封率和对细胞的毒性检测。 结果： 1.聚合物分子量小于15000时，可得到高产率PLGA纳米粒。但PLGA纳米粒产率随分子量增加缓慢降低。纳米粒产率均随乙醇体积分数的增大而提高。 2.制备的纳米粒平均粒径均小于182 nm，乙醇可影响纳米粒粒径。 3.随着质粒DNA浓度增高，纳米粒包封率增加；但是PLGA种类对包封率的影响不大。 4.PLGA-NP在低于100ng/μl的浓度下对HepG2细胞无明显的细胞毒性，在低于200 ng/μl的浓度下对3T3细胞无明显的细胞毒性。而当纳米粒浓度继续增加时，细胞毒性效应则急剧增强。 第三章：PLGA-NP与PcDNA16-53的连接 目的：将pcDNA16-53与PLGA纳米粒进行连接，制备出PLGA-pcDNA16-53纳米粒。并分析其DNA结合效率，对所结合质粒DNA的保护作用以及评价其体外基因转运效率。 方法：制备PLGA-pcDNA16-53纳米粒。测定PH值对DNA结合能力的影响，PLGA-NP与DNA结合的凝胶阻滞实验和DNA沉淀实验；通过PLGA-NP的DNaseI保护试验和血清保护试验判断其对所结合的质粒DNA的保护作用；用绿色荧光蛋白报道基因pEGFP-N1表达质粒评价其体外基因转运效率。 结果： 1.在中性(pH=7)条件下，DNA结合能力最强；当纳米粒与DNA比例达10：1时，DNA几乎完全结合到PLGA-NP上，结合效率达92％。 2.PLGA-NP纳米粒中的DNA经DNaseI消化1小时后或胎牛血清消化8小时，仍然保持结构的完整、未被降解，而裸DNA在同样条件下即被完全降解。 3.PLGA-NP系统能有效转运外源质粒DNA进入HepG2和3T3细胞，表达EGFP蛋白。其转运效率可达约48％，略高于SuperFectTransfeetion Reagent转染试剂的转运效率(43％)。 第四章：PLGA-pcDNA16-53进行肝癌基因治疗的实验研究 目的：通过体外实验和体内实验研究PLGA-pcDNA16-53对肝癌的治疗作用。 方法： 1.体外实验：肝细胞癌HepG2细胞株随机分为A组：RPMI-1640对照组、B组：PLGA空白纳米粒组、C组：PLGA-pcDNA16-53组。质粒抽提并转化至对应细胞组，Western blotting蛋白印迹法检测肝癌肿瘤细胞内源性p16、p53基因的表达，MTT法检测转染质粒后的细胞生长增殖的变化并通过光镜、电镜及DNA凝胶电泳观察细胞凋亡的情况。 2.体内实验：HepG-2肝癌细胞皮下接种裸鼠，建立皮下肝癌移植瘤模型。将16只裸鼠随机分成2组，每组8只，分为实验组(接种HpeG2后24hr内每只裸鼠在接种部位皮下缓慢注射100μg(200μl)PLGA-pcDNA16-53，3天一次，连续5周；对照组肿瘤接种部位皮下注射等量生理盐水。观察肿瘤体积变化和成瘤率。5周后处死，Westernblowing蛋白印迹法检测肿瘤组织p16、p53表达，流式细胞技术检测组织细胞凋亡。 结果： 1.Western blot检测结果显示C组细胞内可检出16KD大小的p16和53KD大小的p53条带。A组和B组细胞内无蛋白条带。 2.A组细胞抑制率为0.34±0.06，B组为0.41±0.04，C组为0.86±0.07；与A组和B组比较，C组肿瘤细胞的抑制作用明显。 3.光镜和电镜下均可以看到C组细胞表现为明显的凋亡状态，DNA凝胶电泳可见到特异性条带，而A组和B组细胞均未见明显凋亡改变及特异性条带。 4.裸鼠均在2周左右成瘤，成瘤率100％。实验组裸鼠瘤重0.84±0.19，明显低于对照组 1.08±0.15。且经PLGA-pcDNA16-53局部注射后，肿瘤抑制率达53.8％。实验组裸鼠成瘤时间超过2周，迟于对照组。 5.Western blot检测结果显示实验组肿瘤组织内可检出16KD大小的p16和53KD大小的p53条带。对照组未检测出蛋白条带。 6.实验组小鼠平均凋亡率为(11.33±3.48)％，对照组小鼠平均凋亡率为(3.07±0.29)％，实验组小鼠平均凋亡率高于对照组小鼠。 结论： 1.PLGA-NP在中性(pH=7)条件下，DNA结合能力最强；纳米粒与DNA比例达10：1时，结合效率高，无细胞毒性。 2.PLGA-NP与PcDNA16-53连接制备的PLGA-pcDNA16-53纳米粒，具有很好的抗核酸酶和抗血清消化能力。 3.PLGA-NP能有效将p16、p53基因转入HepG2细胞，并使其在细胞内正常表达。 4.转染pcDNA16-53明显抑制细胞活力，光镜和电镜下均可以看到细胞表现为明显的凋亡状态，DNA凝胶电泳可见到特异性条带。 5.经PLGA-pcDNA16-53局部注射后，组织可表达p16和p53，肿瘤生长被抑制，组织出现凋亡细胞