论文部分内容阅读
目的:心肌缺血再灌注损伤（Myocardial ischemia/reperfusion injury,MI/RI）是急性心肌梗死的常见并发症,可能造成心肌严重损害。虽然目前已有大量关于MI/RI的研究,但其具体分子机制仍未完全阐明。本研究通过生物信息学方法分析MI/RI基因表达谱,探索可能发挥关键作用的基因和信号通路。方法:通过GEO数据库获得心肌缺血再灌注（Myocardial ischemia/reperfusion,MI/R）数据集。利用GEO数据库在线分析工具GEO2R对数据标准化处理并分析得到差异表达基因（Differentially expressed genes,DEGs）。使用Fun Rich软件分析不同数据集的DEGs,获得共同DEGs。利用DAVID数据库对共同DEGs进行基因功能注释和信号通路富集分析。使用STRING数据库对共同DEGs构建蛋白质相互作用（Protein-protein interaction,PPI）网络,并筛选出关键基因。利用micro RNA.org数据库、mi RTar Base数据库和CTD数据库筛选共同DEGs相关的mi RNA和小分子药物。结果:检索GEO数据库得到MI/R数据集GSE61592和GSE67308。GSE61592采用GPL6887平台,包含3个正常心脏样本和3个缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）心脏样本。GSE67308采用GPL7202平台,包含4个正常心脏样本和4个I/R心脏样本。使用GEO数据库在线分析工具GEO2R分析获得GSE61592和GSE67308的DEGs。GSE61592中共有405个DEGs,其中上调基因218个,下调基因187个;GSE67308中共有381个DEGs,其中上调基因225个,下调基因156个。使用Fun Rich软件分析两个数据集的DEGs,得到20个共同DEGs:S100A8、CCL7、CLEC4D、CHIL3、CCL4、S100A9、HMOX1、PLAC8、SERPINA3N、CCL2、ANGPTL4、SERPINA3G、CYP1B1、LILRB4A、CH25H、LCN2、HP、SAA3、IL33、G0S2。利用DAVID数据库对共同DEGs进行基因功能注释和信号通路富集分析,结果显示这些基因编码的蛋白主要位于细胞外基质,主要功能为结合Toll样受体4（Toll-like Receptor 4,TLR4）、结合趋化因子受体、抗氧化等,主要参与趋化反应、炎症反应、白细胞迁移等生物学进程,富集的KEGG信号通路主要有白细胞介素（Interleukin,IL）-17信号通路、趋化因子信号通路、细胞因子-受体相互作用信号通路和细胞质DNA感应信号通路。利用STRING数据库构建共同DEGs的PPI网络,并根据综合得分筛选出7个关键基因:CCL2、LCN2、HP、CCL7、HMOX1、CCL4、S100A8。通过Micro RNA.org数据库和mi RTar Base数据库筛选出共同DEGs相关的6个mi RNA:mi R-24-3p、mi R-26b-5p、mi R-2861、mi R-217、mi R-4251和mi R-124-3p。利用CTD数据库筛选出共同DEGs相关的小分子,包括臭氧、莫格他唑、阿霉素、罗格列酮、曲格列酮、n-3多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids,PUFAs）。结论:基于MI/RI基因表达谱筛选DEGs、mi RNA和小分子药物是可行的,CCL2、LCN2、HP、HMOX1和S100A8作为关键DEGs可能在MI/RI发挥重要作用,臭氧、曲格列酮、罗格列酮和n-3 PUFAs可能成为MI/RI的候选治疗药物或辅助治疗药物。目的:心肌缺血再灌注损伤时心肌组织发生强烈的无菌性炎症反应,激活核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3）炎性体,诱导细胞焦亡,促进细胞因子释放,进一步加重心肌损伤。25-羟基胆固醇（25-hydroxycholesterol,25-HC）是胆固醇25-羟化酶（Cholesterol 25-hydroxylase,CH25H）的活性产物,由胆固醇转化而来,研究显示CH25H和25-HC对NLRP3炎性体具有调控作用。前期工作发现在氧糖剥夺/复氧（Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R）诱导的H9c2心肌细胞损伤中,CH25H表达明显上调,但CH25H和25-HC在OGD/R损伤中的作用尚不清楚。本研究旨在探讨CH25H和25-HC在OGD/R诱导的H9c2心肌细胞损伤中的作用及相关机制。方法:使用H9c2心肌细胞构建OGD/R模型模拟体内MI/RI。首先,对细胞氧糖剥夺6小时,然后分别复氧3小时、6小时、12小时,检测细胞存活率、LDH水平、细胞焦亡、CH25H、NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β表达,确定复氧时间,然后按照确定的氧糖剥夺时间和复氧时间进行后续实验。在细胞复氧阶段,分别使用不用浓度的25-HC（0.4μM、2μM、10μM、50μM）处理,检测细胞存活率、LDH水平、NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β蛋白表达,确定合适的25-HC浓度进行后续实验。按照干预因素不同,将细胞分为9组:Control组、OGD/R组、OGD/R+si-NC（转染阴性对照si RNA）组、OGD/R+si-CH25H（转染CH25H si RNA）组、OGD/R+25-HC组、OGD/R+si-CH25H+25-HC组、OGD/R+25-HC+BAY 11-7082（NLRP3抑制剂）组、OGD/R+25-HC+NAC（活性氧抑制剂）组和OGD/R+25-HC+TUDCA（内质网应激抑制剂）组。使用CCK-8试剂盒检测细胞存活率,乳酸脱氢酶检测试剂盒测定LDH水平,Hoechst 33342/PI染色检测细胞焦亡,DCFH-DA检测细胞内ROS水平。RT-q PCR和Western blot检测CH25H、NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β的m RNA和蛋白表达水平。Western blot和免疫荧光检测ATF4、BIP、CHOP的蛋白水平。结果:（1）确定复氧时间:H9c2细胞氧糖剥夺6小时后,分别复氧3小时、6小时、12小时,细胞存活率随复氧时间延长而降低,LDH水平和焦亡细胞随复氧时间增加而增加,CH25H、NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β的m RNA和蛋白表达量也随复氧时间延长而增加。因此选择氧糖剥夺6小时,复氧12小时进行后续实验。（2）确定25-HC浓度:在H9c2细胞复氧阶段,分别使用不用浓度的25-HC（0.4μM、2μM、10μM、50μM）处理,检测细胞存活率、LDH水平、NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β蛋白水平。细胞存活率随25-HC浓度增加而增加,LDH水平、CH25H、NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β蛋白表达随25-HC浓度升高而降低。因此选择25-HC（0.4μM）进行后续研究。（3）CCK-8实验:OGD/R组细胞存活率明显低于对照组,OGD/R+si-NC组存活率和OGD/R组无显著差异,OGD/R+si-CH25H组细胞存活率明显高于OGD/R+si-NC组,而OGD/R+si-CH25H+25-HC组存活率较OGD/R+si-CH25H组显著降低。OGD/R+25-HC组细胞存活率明显低于OGD/R组,而BAY 11-7082、NAC、TUDCA可以抑制该作用,使细胞存活率升高。（4）LDH检测:和对照组相比,OGD/R组细胞释放LDH水平明显升高,OGD/R+si-NC组和OGD/R组无明显差异,OGD/R+si-CH25H组LDH水平显著低于OGD/R+si-NC组,而OGD/R+si-CH25H+25-HC组LDH较OGD/R+si-CH25H组明显增多。OGD/R+25-HC组细胞释放LDH显著高于OGD/R组,而BAY 11-7082、TUDCA能逆转该效应,降低LDH水平。（5）Hoechst 33342/PI染色:相比于对照组,OGD/R组焦亡细胞明显增多,OGD/R+si-NC组焦亡细胞和OGD/R组无显著差异,而OGD/R+si-CH25H组焦亡细胞显著少于OGD/R+si-NC组。OGD/R+25-HC组焦亡细胞明显多于OGD/R组,而BAY 11-7082、NAC预处理组焦亡细胞显著减少。（6）ROS检测:OGD/R组细胞内ROS水平高于对照组;和OGD/R组相比,OGD/R+siCH25H组ROS明显降低,OGD/R+25-HC组ROS水平显著升高;OGD/R+25-HC+NAC组细胞内ROS明显低于OGD/R+25-HC组。（7）RT-q PCR检测:OGD/R组CH25H、NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β的m RNA水平显著高于对照组,OGD/R+si-NC组和OGD/R组无明显差异,而OGD/R+si-CH25H组上述m RNA水平明显低于OGD/R+siNC组。（8）Western blot检测:和对照组相比,OGD/R组CH25H、NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β、ATF4、BIP、CHOP蛋白表达水平明显升高,OGD/R+si-NC组和OGD/R组无显著差异,OGD/R+siCH25H组各蛋白水平明显低于OGD/R+si-NC组,而OGD/R+si-CH25H+25-HC组NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β蛋白表达量较OGD/R+si-CH25H组明显升高。相比OGD/R组,OGD/R+25-HC组NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β、ATF4、BIP、CHOP蛋白水平显著增加,而BAY 11-7082、NAC可以抑制NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β表达,TUDCA能减少ATF4、BIP、CHOP、NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β蛋白表达。（9）免疫荧光检测:OGD/R组ATF4、BIP、CHOP的荧光强度明显高于对照组,OGD/R+si-NC组和OGD/R组无显著差异,OGD/R+si-CH25H组各蛋白荧光强度明显低于OGD/R+siNC组。结论:CH25H在OGD/R处理的H9c2心肌细胞中表达明显增加,CH25H及活性产物25-HC通过促进ROS生成和内质网应激,激活NLRP3炎性体,进而诱导细胞焦亡,加重OGD/R诱导的心肌细胞损伤。