创伤、肿瘤、感染等原因造成的四肢大段骨缺损是骨科临床工作中常见而棘手的问题。当骨缺损的范围超过了机体修复能力时，会引起肢体短缩、畸形，最终导致肢体功能障碍。为了解决大段骨缺损这一难题，人们尝试使用异体骨、自体骨移植、骨骼延长术等多种方法来修复骨缺损，但因存在机体排异、传播疾病、来源有限、产生新的创伤等问题而效果不佳。随着生物学和材料学的发展，以这两门学科为基础的生物工程技术为解决这一临床难题带来了新的希望。该技术的关键要素包括：具有成骨活性的功能细胞，有良好骨传导性和骨诱导性的生物材料；主要技术路线：将细胞与生物材料复合，细胞能够在合适的条件下扩增、分化、分泌细胞外基质，最终构成具有活性的组织工程骨。与其他器官的组织工程技术一样，在骨组织工程中不仅要模拟适合细胞生存的体内环境，还要大幅度提高细胞培养、分化的效率，因此静态培养模式远远不能满足需要，必须借助生物反应器来构建活性人工骨。虽然目前已有多种面向骨组织工程的生物反应器问世，但大多为构建体积较小、外形简单的组织工程骨而设计，缺乏适合构建体积较大、结构复杂活性人工骨的生物反应器。本实验以柱状多孔磷酸三钙生物陶瓷（β-TCP）和兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）为研究对象，设计、制造了一种新的复合型灌注式生物反应器，研究通过改进生物反应器设计来提高体外构建大体积活性组织工程骨效率的可行性。一、复合型灌注式生物反应器的设计与制造目的构建一种能在灌注室内产生间歇性低压的复合型灌注式生物反应器，观察其对长节段、多孔β-TCP材料的灌注效果。方法组配式生物反应器的主要构件如Berzelius烧杯、铝合金板材等材料均为市售，按照设计进行搭建。其结构特点是蠕动泵驱动培养液在灌注室内灌注支架的同时，自动控制的真空泵可以在灌注室内产生间歇性低压。用非永久性食用色素颗粒染色的柱状β-TCP分别在常压和间歇性低压环境中（-0.01Mpa，0.5Hz）以不同的灌注率进行灌洗，比较材料色素颗粒洗脱效果，以研究新的灌注环境对不同灌注率下材料内灌注液行为的影响。结果常压环境中，较高地灌注流量能更充分地洗脱颗粒，但在材料上半部仍有残留；即使灌注率较低时，在间歇性低压环境中的材料上所染的色素颗粒能更均匀地被洗脱。结论间歇性低压环境可以影响灌注液流在长节段、柱状多孔β-TCP材料内的行为，使低灌注率下灌注液在材料内均匀分布，避免高灌注率对细胞的剪切力损伤。二、兔BMSCs/材料复合方法的研究目的寻找一种简单、高效的BMSCs与空心柱状β-TCP支架材料的复合方法，并且适于细胞/材料复合体的进一步体外灌注培养。方法取10月龄新西兰大白兔双侧股骨骨髓，反复贴壁法纯化、培养BMSCs。使用第2代BMSCs制成1×10~7/ml、5×10~6/ml和1×10~6/ml细胞浓缩液，分别以0.1、0.2和1.0ml的体积缓慢滴注于柱状β-TCP材料内部的管道中，分别记为方法A、B、C，记录各组操作所耗时间。静置两小时后收集从材料中渗出的BMSCs并计数，计算各种方法的细胞/材料复合率。结果在三组方法中，方法A、B最为快捷（2.13±0.13min、2.07±0.16min），操作C耗时较长（4.60±0.21min）；B组的细胞/材料复合率最高（64.33±2.20%），高于B、C两组（54.00±1.67%、54.17±2.90%），以上差异均有统计学意义（P<0.05）。结论基于β-TCP特殊的构型，浓缩细胞悬液滴注法是一种理想的细胞/材料复合方法。三、BMSCs/β-TCP复合体在复合型灌注式生物反应器中的培养目的在复合型生物反应器中培养BMSCs/β-TCP复合体，通过检测代谢、成骨分化指标，观察该生物反应器的培养效果。方法将BMSCs/β-TCP复合体分别进行静态、常压灌注和间歇性低压灌注培养，记为对照组、实验组Ⅰ、实验组Ⅱ。各组均经历为期1周、2周、3周和4周四个阶段的培养，定时收集培养液检测葡萄糖日耗量、碱性磷酸酶比活性、骨桥蛋白水平，在各培养周期的终末行细胞活力（MTT）和硬组织切片检查。结果在培养各时间点时，实验组Ⅱ的日均葡萄糖消耗量和细胞活力均高于实验组Ⅰ和对照组（P<0.05）；实验组Ⅱ中碱性磷酸酶比活性和骨桥蛋白水平最高，但其浓度曲线的高峰相均较实验组Ⅰ和对照组推迟；硬组织切片检查提示实验组Ⅱ中细胞在材料内的分布更均匀、占孔率更高。结论复合型灌注式生物反应器制造和使用简便，其设计理念适于构建大体积、特殊构型的活性组织工程骨。