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研究背景:冠状动脉粥样硬化性疾病((Coronary atherosclerotic disease,CAD)能够引起心脏功能失调和心力衰竭,是由遗传因素和环境因素等多种因素相互作用导致的血管性疾病,CAD病死率逐年增加,其中最严重的类型则是心肌梗死(Myocardial Infarction,MI)[1]。MI有较高的死亡率,能对心肌组织造成严重的损害。研究发现AMI患者的直系亲属和相同危险因素的同龄未患MI者相比,心脏损伤的几率增加50%-80%,表明基因变异已成为CAD发病的危险因素之一[2,3]。自噬作为真核细胞内一种广泛存在的正常生理过程,参与机体炎症、心脏疾病、免疫疾病、神经性疾病等。自噬作为机体内在的调节机制,通过降解细胞内非必需蛋白及受损细胞器而维持细胞稳态。自噬参与心血管疾病的病理过程,如心肌肥厚、心衰及缺血性心脏病等[4]。在心脏中,自噬水平增强会减小梗死面积[5,6]。自噬相关蛋白5(ATG5)是参与自噬过程中自噬小体形成的关键分子,ATG5水平变化会引起自噬水平改变。研究证实ATG5参与心脏的发育、心肌祖细胞的分化及CAD的发展过程[7]。众所周知,在基因表达过程中,启动子调控目的基因表达。由此,我们猜测ATG5基因启动子序列发生变异可能在心肌梗死发生过程中起到异常重要的作用。目的:本次研究拟针对急性心肌梗死病人和健康对照人群,按照病例-对照研究的方法,找出ATG5基因启动子序列的变异位点,构建变异序列的pGL3基因表达载体,检测各变异位点相关的双荧光素酶活性,借助合适的统计学分析方法,探讨变异位点造成的ATG5基因启动子转录水平的变化;运用JARSPER软件预测ATG5基因启动子变异相关转录因子的改变,并通过凝胶迁移实验(EMSA)检测蛋白与DNA结合情况,进一步验证ATG5基因变异是否影响转录因子的结合,进而影响下游蛋白在急性心肌梗死中的作用。方法:1.该研究将符合条件的研究对象分为:AMI组(378例)和健康对照组(386例),分别收集两组人群相应的临床病例资料和空腹外周血标本,并在血液样本中提取全基因组DNA;2.通过NCBI基因数据库,查看人类ATG5基因启动子序列,并以此为依据设计引物,体外扩增ATG5基因目的启动子片段,整理统计基因测序结果,从而确定与ATG5基因目的序列的DNA序列变异(DSVs)和单核苷酸多态性位点(SNPs);3.将统计的DSVs和SNPs的片段及ATG5基因启动子的野生型序列分别连接到克隆载体,下一步提取重组质粒,经酶切后,连接至pGL3-basic报告基因载体,构成重组双荧光素酶报告质粒;4.将内参质粒pRL-TK和pGL3-basic报告基因载体通过脂质体共转染的方法,瞬时转染至体外培养的HEK-293细胞和H9c2心肌细胞,借助双荧光素酶报告基因分析仪分别检测上两种细胞培养后的双荧光素酶活性,统计荧光值,初步分析基因转录水平因ATG5基因启动子序列各变异位点所造成的影响;5.ATG5基因启动子序列变异位点引起相关转录因子的改变借助JASPAR软件预测,以DNA变异位点序列为基础设计生物素标记探针,分别与HEK-293细胞和H9c2细胞的核提取物进行凝胶迁移实验(EMSA),利用化学发光法检测生物素标记探针与核蛋白的结合情况,分析转录因子在ATG5基因启动子上的结合位点是否会受各DSVs的影响。结果:1.通过将PCR产物进行测序,共找出15个A1TG5基因启动子变异,其中AMI组包括:一个缺失变异g.106326169 delAGA和一个基因突变g.106325751 C>G,后者位于ATG5基因序列第一个外显子;健康对照组包括:3个DSVs g.106326292 C>A、g.106325849 G>A和g.106325912 A>G;另外在AMI组和健康对照组两组中均发现 4 个 DSVs:g.106326739 T>C、g.106326486C>T、g.106326330 G>A和g.106325874 C>T,1个插入变异:g.106326426 insT,5个SNPs:g.106326588(rs506027)C>T、g.106326583(rs1 87678668)T>A、g.106326547(rs1 17781908)C>A、g.106326542(rs1 82877945)C>A 和g.106326154(rs510432)A>G,经统计学分析得出无统计学意义;2.上述测序结果中具有统计学意义的DSVs和SNPs以及ATG5基因启动子野生型构建pGL3-basic报告基因载体质粒:pGL3-Wild Type(WT)、pGL3-g.106326169 delAGA、、pGL3-g.106326292 A、、pGL3-g.106325849 A、pGL3-g.106325912 G及 pGL3-g.106326154 G;3.利用脂质体瞬时转染法,pGL3报告基因重组质粒分别转入HEK-293细胞和H9c2心肌细胞,检测双荧光酶素酶活性,结果显示,仅AMI组中g.106326169 delAGA,能改变ATG5基因启动子转录活性(P<0.01),其余健康对照组DSVs及SNPs对ATG5基因启动子的转录活性并未发现显著影响(P>0.05);4.将AMI组的DSV进行EMSA,经化学发光法检测细胞核蛋白与DNA结合情况,发现g.106326169 delAGA变异位点与蛋白有特异性结合条带,并且WT和DSV与蛋白之间的结合情况有明显差异。结论:本研究主要在功能变异和遗传变异两个方面,探讨了ATG5基因启动子序列,发现了 ATG5基因启动子序列的低频变异位点,在AMI病人中会影响ATG5基因启动子的转录活性,从而引起基因表达水平的改变,进一步影响AMI的发生发展过程,完善了自噬在心肌梗死方面的研究。