胰腺癌是一种高度恶性的肿瘤，其死亡率位居全部恶性肿瘤的第四位，在我国其发病率呈现出逐年上升的趋势。由于手术治疗及传统的放化疗并不能明显提高患者的5年生存率，因此肿瘤免疫治疗逐渐成为胰腺癌治疗研究的热点。然而，因为肿瘤免疫逃避机制的存在，肿瘤免疫治疗往往不能达到令人满意的效果。因此，以肿瘤免疫及相关机制为对象的研究成为目前攻克肿瘤免疫耐受及免疫逃避，实现有效治疗的重要手段。树突状细胞（dendritic cell DC)是目前发现的功能最强大的抗原递呈细胞，在抗原递呈、T细胞活化及免疫耐受方面发挥着重要的作用。研究发现，肿瘤细胞可逃避免疫系统而存活，同时建立肿瘤微环境来抑制DC的成熟及相关的免疫功能；胰腺癌细胞上清液可明显抑制DC的分化和抗原递呈功能；胰腺癌患者血清中的DC数量和功能亦明显受抑，但其中详细的机制仍然不十分明了。综上所述，明确胰腺癌微环境下DC的受损机制成为克服肿瘤免疫逃避、提高免疫治疗的重要前提条件。微小RNA（miRNA）是一类由20-23个核苷酸组成的内源性非编码小分子单链RNA,能够识别特定的目标mRNA，参与转录后水平的基因调控，在机体的正常生理活动和各种疾病的发生、发展过程中都起着重要的调节作用。研究表明，miRNA-146a在免疫反应、炎症反应以及细胞的增殖、分化、成熟过程中都起着十分重要的调节作用。最新的研究显示，miRNA-146a对DC的增殖分化及成熟也起着重要的调控作用。基于上述理论，本实验采用恶性程度较高的胰腺癌BxPC-3细胞系为研究对象，探讨在胰腺癌BxPC-3细胞上清液（BxPC-3-conditioned medium, BxCM）的作用下，DC内miRNA-146a的变化及其对DC成熟和功能的影响，以揭示胰腺癌微环境抑制DC的相关分子机制。第一部分人外周血来源DC的制备及BxCM对其分化成熟抑制作用的研究目的：体外分离培养人外周血来源的DC，观察BxCM对DC分化成熟的抑制作用。方法：取健康志愿者外周血，使用淋巴细胞分离液分离获得CD14+单核细胞。体外联合应用重组人粒细胞集落刺激因子（GM-CSF）及白细胞介素4（IL-4）诱导其分化为DC，应用肿瘤坏死因子α（TNF-α）促进其成熟。利用人胰腺癌BxPC-3细胞系提取BxCM，与上述细胞因子共同诱导CD14+单核细胞。流式细胞仪检测DC分化成熟相关抗原分子的表达情况，观察BxCM对DC分化成熟的抑制作用。结果：体外成功分离培养出人CD14+单核细胞，并诱导其分化成为成熟的DC；与常规培养组相比，BxCM干预下诱导的DC，其CD14仍维持在高水平（P＜0.05），而CD1a、CD80、CD83、CD86及HLA-DR等DC成熟相关表面抗原的表达则显著降低（P＜0.05）。结论：BxCM能够显著抑制DC表面抗原的表达，进而阻碍CD14+单核细胞向DC的分化及DC的成熟。第二部分BxCM对DC内miRNA-146a及Smad4蛋白表达的影响目的：研究BxCM干预下DC内miRNA-146a及Smad4蛋白表达水平的变化，探讨miRNA-146a与Smad4蛋白表达之间的关系，为进一步阐明DC受抑机制提供理论依据。方法：通过QRT-PCR法比较常规培养组与BxCM干预组中DC内miRNA-146a表达水平的变化；通过QRT-PCR及Western-blot法比较两组DC内Smad4基因mRNA与蛋白表达变化。同时应用脂质体2000（Lip2000）将anti-miRNA-146a寡核苷酸或非特异性寡核苷酸片段转染至DC内沉默miRNA-146a的表达，以探讨miRNA-146a与Smad4蛋白表达之间的关系。结果：与常规培养组中DC相比，BxCM干预组中DC内miRNA-146a的表达均显著增高（P＜0.05）；与此相反，Smad4的mRNA与蛋白表达则明显低于常规培养组（P＜0.05）。同时，当miRNA-146a的表达被有效沉默后，常规组及BxCM干预组中DC内Smad4的mRNA与蛋白表达的水平均明显上调（P＜0.05）。结论：DC内miRNA-146a可负向调节Smad4蛋白的表达。BxCM在抑制DC分化成熟的同时，能够显著上调DC内miRNA-146a的表达水平；而作为miRNA-146a负向调控的靶基因之一，Smad4的表达水平则明显降低。因此，BxCM有可能通过miRNA-146a-Smad4介导的信号通路抑制DC分化成熟。第三部分下调BxCM诱导的DC内异常增高的miRNA-146a水平对DC成熟及免疫功能的影响目的：研究下调BxCM干预组中DC内miRNA-146a的表达水平对DC分化成熟及免疫功能的影响，探讨胰腺癌微环境下DC成熟及免疫功能受抑制的详细机制，为DC介导的抗胰腺癌免疫治疗提供必要的理论及实验依据。方法：应用Lip2000将anti-miRNA-146a寡核苷酸转染至BxCM干预组的DC内，以沉默miRNA-146a的表达。流式细胞仪检测各组DC分化成熟相关抗原的表达变化情况；酶联免疫吸附实验（ELISA）测定各组DC的IL-12分泌水平。利用胰腺癌BxPC-3细胞的裂解物制备全肿瘤特异性抗原并负载DC，各组致敏的DC按DC:T淋巴细胞为1:10的比例混合培养（混合淋巴细胞反应， MLR）。24小时后ELISPOT法测定各组干扰素-γ（IFN-γ）分泌水平，ELISA测定各组T淋巴细胞IL-12的分泌水平。5天后MTS法测定各组淋巴细胞增殖情况；乳酸脱氢酶(LDH)释放实验观察各组DC体外诱导的主动特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）反应对BxPC-3细胞的杀伤作用。结果：与BxCM干预组中DC相比，下调DC内miRNA-146a的表达水平能显著增加DC表面分子CD1a、CD80、CD83、CD86及HLA-DR的表达（P＜0.05），但仍低于正常水平。同样，抑制DC内miRNA-146a的过度表达虽然不能完全恢复其刺激T细胞增殖及激活CTL的能力，但是与BxCM干预组中DC相比，其免疫功能显著提高（P＜0.05）。结论：体外BxCM对DC成熟及免疫功能的抑制作用在一定程度上是通过上调DC内miRNA-146a的表达水平来实现的。