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背景与目的恶性肿瘤的发展变化在某种程度上取决于肿瘤与免疫系统之间的相互作用。机体免疫能力下降是肿瘤发生、发展的一个重要原因。因此,增强机体免疫力,促进肿瘤细胞凋亡是肿瘤治疗的一个重要目标。研究发现细胞凋亡主要有线粒体和死亡受体两条途径。FasL是重要凋亡分子,与死亡受体Fas结合后诱导细胞膜表面Fas分子聚集形成三聚体启动细胞凋亡的信号传递诱导Fas阳性细胞凋亡。Fas广泛表达于体细胞,而FasL在正常情况下仅表达于活化T细胞,以及眼、睾丸、胎盘等特殊组织。Caspase是执行凋亡的主要酶类,Caspase-3是一种特异性半胱氨酸蛋白酶,在Caspase酶系级联反应中发挥重要作用。研究发现恶性肿瘤间质内存在以T淋巴细胞为主的淋巴细胞群体,称之为肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)。TILs通过表达FasL蛋白诱导肿瘤细胞凋亡发挥其杀瘤活性。然而,TILs与非小细胞肺癌均表达FasL,非小细胞肺癌表达FasL和Caspase-3与肿瘤浸润淋巴细胞凋亡之间存在什么关系?肿瘤细胞高表达FasL能否引起宿主TILs凋亡,从而发挥反杀伤作用,逃避宿主免疫监视?肿瘤细胞高表达FasL是否与肿瘤浸润淋巴细胞分泌的细胞因子有关?表达FasL是不是NSCLC在接受来自TILs分泌细胞因子刺激后采取的一种反击宿主免疫系统的措施?相信深入研究非小细胞肺癌FasL、Caspase-3表达与肿瘤微环境中TILs的关系可能具有重要生物学意义。方法本研究采取以下方法:1.将手术切除45例非小细胞肺癌标本及远癌肺组织作为研究对象,应用免疫组织化学方法检测FasL、Caspase-3蛋白表达。2.应用激光微切技术获取非小细胞肺癌周边区和非周边区域肿瘤细胞,共10例,应用RT-PCR技术检测不同区域肿瘤细胞FasL和Caspase-3 mRNA表达。3.应用免疫组织化学技术标记肿瘤浸润淋巴细胞45例,结合应用TUNEL法检测肿瘤浸润淋巴细胞凋亡情况,原位检测非小细胞肺癌肿瘤浸润淋巴细胞凋亡比例。4.筛选出4份HLA-A2+ PBL;A549细胞转染质粒后稳定表达HLA-A2+,表达HLA-A2的PBL成为A549细胞的特异性TILs。HLA-A2+ PBL培养后细胞计数为3×105/ml,共246ml,离心后共获得96ml上清液。分别应用50μl、100μl、150μl、200μl、250μl和500μl肿瘤浸润淋巴细胞上清液与A549细胞共培养30min、60min、120min、180min和240min,设立阴性对照组,应用RT-PCR和Western blot技术分别检测A549细胞在不同时间、不同剂量肿瘤浸润淋巴细胞上清液共培养时FasL和Caspase-3 mRNA和蛋白表达。5.所得结果采用SPSS 10.0进行相应的统计学分析。结果本课题研究主要结果如下:1.非小细胞肺癌FasL表达检查结果:⑴肺腺癌FasL表达率为73.3%±15.8%,肺鳞状细胞癌FasL表达率为60.4 %±15.8 %,腺癌FasL表达显著高于鳞状细胞癌(p<0.01);⑵中高分化肺癌FasL表达率为60.6 %±15.8 %,低分化肺癌FasL表达率为70.1 %±16.9 %,低分化肺癌FasL表达显著高于中高分化肺癌(p<0.05);⑶伴淋巴结转移组NSCLC FasL表达阳性率为62.4 %±15.6 %,无淋巴结转移组肺癌FasL表达阳性率为55.8 %±11.9 %,伴淋巴结转移组肺癌FasL表达率显著高于无淋巴结转移组(p<0.05);⑷本组单纯以肺癌pTNM分期统计分期,各期间统计比较无显著差异,将Ⅰ+Ⅱ期、ⅢA+ⅢB期分别合并后再进行统计分析,前者FasL表达阳性率为62.4%±15.6 %,而后者FasL表达阳性率为72.8 %±18.0 %,ⅢA+ⅢB期非小细胞肺癌FasL阳性率显著高于Ⅰ+Ⅱ期非小细胞肺癌FasL表达阳性率(p<0.05)。⑸NSCLC周边区FasL表达阳性率为74.4 %±18.4 %,而肿瘤非周边区FasL表达率为64.4 %±13.1 %,肿瘤周边区FasL表达显著高于非周边区FasL表达( p<0.05 )。2. NSCLC不同部位FasL、Caspase-3 mRNA表达检测结果:⑴NSCLC周边区FasL mRNA表达强度为0.926 + 0.41;肿瘤非周边区FasL mRNA表达强度为0.892 + 0.26。两组间存在显著差异,(P<0.05 )。⑵肿瘤周边区Caspase-3 mRNA表达强度为0.912 + 0.07;肿瘤团非周边区Caspase-3 mRNA表达强度为0.923 + 0.04。两组间无显著统计学差异,(P>0.05 )。3.非小细胞肺癌Caspase-3蛋白表达检测结果:⑴肺鳞状细胞癌Caspase-3蛋白平均阳性表达率为76.9 %,腺癌Caspase-3阳性表达率为47.4 %,鳞癌Caspase-3表达水平显著高于腺癌(p<0.05);⑵中高分化NSCLC Caspase-3阳性表达率为70.0%,低分化非小细胞肺癌Caspase-3阳性表达率为64.0%,中高分化非小细胞肺癌与低分化NSCLC Caspase-3表达无显著差异(p>0.05);⑶Caspase-3蛋白表达与N分期有关,无淋巴结转移组Caspase-3阳性表达率为81.8%,淋巴结转移NSCLC组Caspase-3阳性率为61.8%,无淋巴结转移组Caspase-3表达水平显著高于淋巴结转移组NSCLC(p<0.05);⑷比较肺癌周边区与非周边区Caspase-3蛋白表达无显著差异(p>0.05)。4. NSCLC肿瘤浸润淋巴细胞凋亡检测结果:⑴肺腺癌组织肿瘤浸润淋巴细胞凋亡指数为5.51±1.56,肺鳞状细胞癌肿瘤浸润淋巴细胞凋亡指数为4.11±2.03,腺癌组织TILs凋亡指数显著高于鳞状细胞癌(p<0.01);⑵中高分化非小细胞肺癌组织中TILs凋亡指数为3.84±1.71,低分化非小细胞肺癌组织TILs凋亡指数为5.38±1.90,低分化肺癌TILs凋亡指数显著高于中高分化NSCLC (p<0.01);⑶不同pTNM非小细胞肺癌组织TILs凋亡指数统计比较无显著差异( P >0.05);⑷TIL凋亡指数随NSCLC FasL表达强度增强而增加,与其表达强度呈显著正相关(r = 0.707, p<0.01)。5.肿瘤浸润淋巴细胞培养上清液与A549细胞共培养后FasL和Caspase-3 mRNA及蛋白检测结果:⑴将TILs上清液250μl与A549细胞共培养60min时,FasL mRNA表达水平显著高于对照组(p<0.05);⑵将TILs上清液200μl和250μl分别与A549细胞共培养90min时,FasL mRNA表达水平均显著高于对照组( p<0.05 ),两组间无显著差异(p>0.05);⑶其他不同剂量TILs上清液与A549细胞共培养时肿瘤细胞FasL mRNA表达水平无显著变化(p>0.05);⑷不同剂量肿瘤浸润淋巴细胞培养上清液与A549细胞共培养时各组FasL蛋白表达与对照组比较均无显著差异(p>0.05);⑸各组A549细胞Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平与对照组比较均无显著差异(p>0.05)。结论本研究得出如下结论:1. FasL蛋白在NSCLC中特异性高表达,而且与NSCLC生物学特点有关,FasL高表达可能是肺腺癌容易早期转移、预后较差的原因之一。2. FasL蛋白在NSCLC肿瘤组织呈不均匀分布,肿瘤细胞周边区FasL蛋白及FasL mRNA表达高于非周边区域。推测肿瘤团外部微环境因素可能影响肿瘤细胞FasL表达。NSCLC周边区细胞可能首先接受来自机体肿瘤浸润淋巴细胞分泌的淋巴因子,或其他体液因子刺激,上调FasL表达,对进入肿瘤团块的肿瘤浸润淋巴细胞实施反制措施,杀伤机体免疫细胞,进而在与机体免疫系统的杀伤与反杀伤战斗中争取生存空间,并进一步生长和发展。3.非小细胞肺癌FasL表达与TILs凋亡率存在密切关系,FasL蛋白表达水平越高,肿瘤浸润淋巴细胞凋亡率越高。高表达FasL蛋白可能意味着该组类型肺癌更容易应用FasL蛋白反杀伤机体肿瘤浸润淋巴细胞及免疫系统。4.肿瘤细胞与TIL上清液共培养时FasL表达上调,提示肿瘤细胞接受来自TIL分泌的某种细胞因子影响或调控。肿瘤细胞在加入TIL上清液60~90min后上调FasL表达,反应较快,但在更长时间的共培养观察中未发现FasL高表达,并且,更大剂量TIL上清液加入肿瘤培养液中反而未发现FasL表达上调现象,其机制不明。参与细胞凋亡因素很多,调控机制复杂,TIL分泌细胞因子参与肿瘤细胞FasL表达尚需要进一步深入研究。