结直肠癌（Colorectal Cancer,CRC）是目前最常见的胃肠道恶性肿瘤之一,结直肠癌的标准化发病率和死亡率在过去几年中不断上升,这主要归因于复发和远处器官转移,而导致复发的主要原因是化疗耐药,从而导致生存率下降。有研究报道,化疗耐药性的形成,与肿瘤细胞的干细胞样特性和化学治疗不敏感有很大关系。目前标准治疗方案为手术结合化疗。2019年NCCN指南推荐的化疗一线方案是以含有奥沙利铂为主的FOLFOX、Cape OX方案,目前临床上仍有部分病人对此方案不敏感,故进一步研究结直肠癌形成干性及耐药性而导致复发可能的分子机制可为临床上诊疗结直肠癌,提供逆转耐药实现精准化疗。MYELOID ECTOPIC VIRAL INTEGRATION SITE（MEIS）蛋白包括MEIS1,MEIS2,和MEIS3等三种类型,在全基因组范围内,主流观点认为MEIS蛋白作为HOX蛋白的辅助因子,它们都含有一个非典型的DNA结合域和启动子区域,形成DNA蛋白复合物,进而影响其在细胞中的作用。其中MESI2已有被证实涉及到人类癌症的发病机制中,MEIS2蛋白表达和功能的异常与多种癌症相关,其所发挥的致癌和抑癌作用取决于不同的器官部位,比如,MEIS2的高表达与卵巢癌患者的预后改善有关,而在神经母细胞瘤、前列腺癌、膀胱癌中,其高表达促进肿瘤发生,并且与其发生转移性疾病相关。然而,MEIS2在CRC中的功能作用仍不清楚。本课题组在前期通过WGCNA等方法得出该基因在结直肠癌中可能抑制肿瘤细胞增殖并影响其干性表达等,且与患者的疾病预后相关。在本研究中,我们将结合本课题组在前期对于MEIS2所做的研究,进一步探讨MEIS2在CRC的表达,并通过构建过表达及敲除MEIS2结直肠癌细胞系检测其对CRC细胞的干性等恶性表型的影响,探索可能的分子机制,在结直肠癌的预防和靶向治疗上提供足够的理论基础。基于以上目的,我们将研究分为以下三个部分:第一部分 MEIS2在结直肠癌细胞和组织中的表达及意义目的:探索MEIS2在结直肠癌细胞和组织中的表达及意义。方法:检测在5株不同的结直肠癌细胞系中和正常结直肠癌上皮细胞NCM460的MEIS2 m RNA表达水平,并通过q RT-PCR实验得出相对高表达MEIS2和相对低表达MEIS2的结直肠癌细胞系各一株。抽取5对结直肠癌患者的癌组织及正常组织进行免疫组化分析;通过生物信息学分析TCGA等数据库在结直肠癌中的表达水平及其临床意义。结果:免疫组化结果提示MEIS2在正常结直肠癌患者主要表达在胞浆和胞核,在结直肠癌组织中低表达或不表达;通过q RT-PCR实验得出结直肠癌细胞系的表达量均低于正常结直肠上皮细胞;高表达MEIS2组的无病生存期高于低表达组,差异具有统计学意义。结论:MEIS2的表达水平在结直肠癌细胞和组织中低于正常结直肠细胞和组织,其表达与结直肠患者预后呈负相关。第二部分 MEIS2调控结直肠癌细胞的干性和奥沙利铂化疗耐药性目的:初步探索MEIS2在结直肠癌细胞调控形成干性和奥沙利铂化疗耐药性。方法:通过慢病毒转染构建过表达和敲除该基因稳定细胞系,采用Western Blot实验和q RT-PCR实验检测慢病毒载体的转染效率及表达水平;进行细胞成球实验检测不同细胞系的成球能力;通过Western blot实验探索其干性标志物的蛋白水平的相对表达;采用CCK-8和平板克隆法分别评估过表达细胞系和敲除细胞系的增殖能力,流式细胞术分析对细胞凋亡的影响;通过MTT实验检测处理不同浓度奥沙利铂处理后的细胞生存率;进行生物信息学分析。结果:成功构建稳定过表达MEIS2的细胞系SW620-MEIS2和DLD1-MEIS2和敲除MEIS2的细胞系SW620-sh RNA-MEIS2和DLD1-sh RNA-MEIS2,及其配对对照组细胞系SW620-NC和DLD1-NC,先用荧光显微镜观察24h后转染情况,再分别采用Western Blot实验和q RT-PCR实验检测慢病毒载体的转染效率,过表达细胞系的该基因的表达水平均显著上升,敲减细胞系的该基因表达均显著下降;MEIS2表达水平较高的SW620成球率明显较低,相比于MEIS2表达水平较低的DLD1细胞的成球率;MEIS2过表达的细胞系成球能力下降,并且相对应的CD133以及Lgr5的蛋白表达水平也降低,而在MEIS2敲除的细胞系中,其成球能力相对增加,相对应的CD133以及Lgr5的蛋白表达水平相对上升。使用CCK-8法和平板细胞克隆法分别评估敲除细胞系和过表达细胞系的细胞增殖情况,检测细胞活力,分别与配对照组细胞系SW620-NC和DLD1-NC相比,过表达细胞系SW620-MEIS2和DLD1-MEIS2中的细胞增殖活力明显下降,而敲除细胞系SW620-sh RNA-MEIS2和DLD1-sh RNA-MEIS2增殖活力与其配对对照组细胞系SW620-NC和DLD1-NC相比则相对上升。在细胞凋亡水平比较,分别与其配对对照组,SW620-MEIS2和DLD1-MEIS2的比例显著降低,SW620-sh RNA-MEIS2和DLD1-sh RNA-MEIS2的比例显著増高。通过MTT实验得出,在同一个浓度下的奥沙利铂的作用下,MEIS2高表达组的生存率低于配对对照组,敲除组的细胞生存率高于配对组;生物信息学分析结果显示,与L-OHP敏感组织相比,L-OHP耐药组织中MEIS2的相对表达明显较低,结果均具有统计学意义（P<0.05）。结论:在体外实验中,高表达MEIS2抑制结直肠癌细胞的干细胞样特性、增殖能力、凋亡能力,与L-OHP化疗耐药中相关,其高表达可以增强其化疗敏感性,在化疗抵抗组中表达降低。第三部分 MEIS2调控结直肠癌细胞的干性及奥沙利铂化疗耐药性可能的分子机制目的:初步探索MEIS2在结直肠癌细胞调控形成干性及耐药性其可能的分子机制,为提供逆转耐药实现精准化疗。方法:通过生物信息学分析可能的上游机制以及Western blot实验以及Caspace-3活性检测验证MEIS2下游机制调控细胞凋亡通路。结果:MEIS2在结直肠癌参与调控的途径之一是在DNA水平在启动子区域Cp G岛甲基化水平升高,使得启动子不能结合至转录因子上,m RNA的表达下调,进而沉默MEIS2的表达;MEIS2在结直肠癌中存在1.7%的错义突变,这一部分的存在导致MEIS2的在结直肠癌中的表达下降;MEIS2的基因拷贝数与MEIS2的表达的负相关关系;与配对对照组相比,在MEIS2过表达的结直肠癌细胞系中检测到caspase-3活性显著增加,而在敲除MEIS2的结直肠癌细胞系中caspase-3活性显著降低;进行MEIS2过表达的两组细胞系相比于配对对照组,在蛋白水平,Bcl-2的减少和Bax的增加,反之,敲除MEIS2的两种细胞系相比与配对对照组,Bcl-2的增加和Bax的减少,符合其生物信息学的分析结果均具有统计学意义（P<0.05）。结论:MEIS2的上游机制包括高甲基化、错义突变、DNA拷贝数异常;MEIS2在启动子区的高甲基化使其在结直肠癌中的表达下调;MEIS2的下游通路包括抗凋亡通路。