金黄色葡萄球菌是人类一种重要的病原体,它能引起坏死性肺炎,心内膜炎和中毒性休克综合症等多种致病严重的疾病,从而严重危害人类健康。sigB基因编码的δB蛋白被认为是一种能在金葡菌遭遇应激时与RNA聚合酶结合形成RNA聚合酶全酶（RNAP）以激活多种应激基因表达的调控因子,它对金葡菌的生存至关重要,因此sigB具有成为抗菌新药靶点的潜力,目前研究主要揭示其在细菌耐酸、耐热、抗氧化等胁迫应激过程中发挥重要作用,对于sigB是否还参与其他生理调控如致病因子合成、诱导群体感应、毒力表达等少有报道,这迫切需要我们对金葡菌sigB基因展开进一步研究以解析sigB基因功能。基因编辑技术一直作为研究基因功能、耐药发病机理、筛选抗菌靶点的关键手段,然而传统的金葡菌基因编辑技术存在耗时耗力且效率低下等问题,目前缺乏一种高效的金葡菌基因编辑技术。CRISPR-Cas9技术是继锌指核酸内切酶、类转录激活因子效应物核酸酶后的新一代基因编辑技术,其凭借高效灵活、可操作性强等优势,被迅速广泛应用于各研究领域。本文便是基于CRISPR-Cas9基因编辑技术构建金葡菌sigB基因敲除系统,并利用p LI50构建对应sigB回补菌株,再通过研究各基因型菌株的生物学特性差异以揭示金葡菌sigB基因功能,为进一步为研究sigB作为抗菌靶点提供基础理论支撑。本课题首先基于pCasSA质粒利用BsaI同序异尾酶一步克隆法构建了靶向sigB基因的CRISPR-Cas9表达载体pCasSA1,然后通过重叠延伸PCR合成用于同源重组修复的同源臂供体,接着通过酶切、T4连接处理将同源臂供体亚克隆至pCasSA1质粒中而获得pCasSA2质粒,随后将pCasSA2电转入S.aureus RN4220中进行质粒修饰而获得pCasSA3敲除质粒,最后将敲除质粒pCasSA3电转入标准菌株S.aureus Newman进行sigB敲除而获得突变株S.aureus△sigB-Newman。在挽救实验中,单拷贝整合质粒p LI50被用于sigB回补菌株的构建,首先将sigB片段亚克隆至p LI50质粒,再通过S.aureus△sigB-RN4220修饰,最后将修饰质粒电转入S.aureus△sigB-Newman从而获得回补株△sigB/sigB-Newman。随后,我们研究了野生株Newman、sigB缺失株、sigB回补株在生长繁殖、生物被膜形成、溶血能力、诱导自溶能力、耐酸耐碱方面的表型差异并结合各基因型菌株在不同生长时期对生物被膜、溶血性、毒力因子、致病因子、群体感应等关联基因的相对表达数据,最后分析出sigB功能如下:1.sigB能提高金葡菌生物被膜的形成及溶血能力,并参与调节细菌毒力表达。2.sigB能抑制Triton X-100诱导金黄色葡萄球菌自溶效应。3.sigB参与金葡菌耐酸机制的调控,而没有明显证据显示其参与金葡菌耐碱机制。4.sigB在金葡菌对数生长平台期能全面上调包括毒力因子、黏附因子、群体感应、生物被膜相关基因的表达。本文通过证明sigB的靶向失活能降低细菌生长后期的毒力表达、生物被膜形成、致病性等负面因素,为研究sigB作为新药抗菌靶点提供正确思路及理论支撑。此外,本研究构建的金葡菌sigB基因的CRISPR/Cas9敲除系统及其回补系统为研究不同金葡菌sigB功能奠定基础,也为进一步研究金葡菌其他基因功能、耐药机制、致病感染机制及开发减毒金葡菌疫苗提供技术平台。