天然的抗体分子是在机体免疫细胞被抗原激活后,由已经分化成熟的终末B细胞合成并分泌的一类免疫球蛋白。作为机体免疫系统的重要组成部分,抗体能够为机体提供有效的免疫防护,同时在科学研究、临床诊断及治疗等领域得到了广泛的应用。随着单克隆抗体制备技术的不断发展,单克隆抗体药物基于其靶向性强、疗效好、副作用小等优点而成为全球生物制药领域的研究开发重点。抗体的体外制备技术的发展先后经历了多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体三个阶段。其中,多克隆抗体是多种特异性抗体的混合,针对的是多个抗原表位,难以鉴定其中每一种抗体的特性和功能；而单克隆抗体基于其特异性和均一性,一旦确定其功能,常成为研究开发的重点。传统的鼠杂交瘤技术所获得的单克隆抗体应用于人体时,存在诱发人抗鼠抗体反应(HAMA)的风险；而随后出现的抗体库技术使筛选获得完全人源的抗体成为可能,为彻底解决HAMA反应带来了希望。其中,噬菌体展示抗体库技术是当前抗体研究领域应用最为广泛的抗体筛选技术之一；通过反复几轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程,可从大容量的噬菌体展示抗体库中获得能够结合特异性抗原的抗体。但噬菌体表面展示抗体库仅可展示抗体的Fab段或单链抗体(scFv),因此,无法直接筛选获得全长抗体；当获得抗体片段后,需要将其改造为全长抗体,而此过程中常存在丢失抗体特异性和亲和力的风险,且改造过程耗时长、成功率低。近十几年以来,逐渐有学者将可展示全长抗体、并可直接筛选获得全长抗体的哺乳动物表面展示系统应用于抗体的筛选；但现有哺乳动物细胞表面展示全长抗体库的库容量仅有106,不足以满足高亲和力、高特异性抗体的筛选需要。因此,如何提高建库的效率、构建大容量的哺乳动物细胞表面展示抗体库成为了一个亟待解决的问题：若能突破现有的哺乳动物细胞表面展示抗体库的库容量的限制,将有利于高亲和力、高特异性全长人源抗体的直接筛选,从而发挥推动抗体制备技术进步的作用。本研究通过应用一组特殊的限制性内切酶、优化载体的结构等方式,构建了一个可以在哺乳动物细胞表面高效展示全长抗体的通用载体,此载体可根据需要插入全长轻链、全长重链或重链可变区。其中,所应用的三种限制性内切酶(SfiI、BstXI、BsmBI)切割之后的末端不能形成自我连接,提高了基因克隆操作过程的效率,从而能够方便地构建大容量的抗体基因库。当分别构建的重链基因库和轻链基因库的容量在105～106的情况下,将重链库和轻链库共转入哺乳动物细胞后,可以利用细胞本身的天然配对机制,使所展示抗体的多样性达到1010以上。当前,以单克隆抗体制剂为代表的生物制剂已经在肿瘤、心血管疾病、自身免疫疾病等领域得到了广泛的应用,美国FDA现已批准22个单克隆抗体药物用于上述疾病的治疗。类风湿关节炎(RA)是一种自身免疫性疾病,机体在发病过程中有可能产生针对自身蛋白的抗体,这些抗体在疾病的发展过程中可能起不同的作用。目前,以TNF-α为作用靶点的可用于治疗RA的单克隆抗体包括三种,分别是英夫利昔单抗(Infliximab, Remicade)、阿达木单抗(Adalimumab, Humira)和塞妥利素单抗(Certolizumab, Cimzia)。然而,现有的上述治疗RA的单克隆抗体有的是人鼠嵌合抗体、有的仅是抗体片段、有的制造成本很高,均在一定程度上制约了单克隆抗体药物在RA治疗中的应用。若能够开发出新的全人源的全长抗体用于研究和治疗RA,必将为广大RA患者带来福音。因此,本研究构建了一个通用的哺乳动物细胞表达载体,建立了一个可以在哺乳动物细胞表面展示的RA患者特异性的全长抗体基因库,并对其进行了分析鉴定,为治疗RA的人源全长抗体的直接筛选提供了大容量的抗体库。利用本研究所构建的载体,以来自于RA患者的外周血淋巴细胞为材料,应用根据V-BASE网站信息所设计合成的全套人抗体重链可变区引物和全套人抗体轻链恒定区引物,建立了库容量为1.14×106的抗体重链基因库(IgG1)和库容量为1.12×105的抗体轻链基因库(Kappa链)。在重链库和轻链库中各挑取10个单克隆进行测序分析,结果表明重链库的10个单克隆中有6个含有正确的重链可变区(VH)编码序列,编码6个特异的氨基酸序列；轻链库的10个单克隆中有8个含有正确的Kappa型轻链(LCκ)编码序列,编码8个特异的氨基酸序列。将此重链库和轻链库共转染哺乳动物细胞后,抗体重链和抗体轻链在哺乳动物细胞内可以依靠其天然配对机制进行随机配对,理论上抗体库的多样性可以达到6.13×1010[(1.14×106×60%)×(1.12×105×80%)]。随后,将上述重链库和轻链库中各挑取的10个单克隆分别与已确定能高效表达人Kappa型轻链、IgG1型重链的载体相配转染293T细胞,流式细胞仪分析表明有7个重链克隆在配对后能够将抗体展示在293T细胞表面并被流式细胞仪检测到；有9个轻链克隆在配对后能够将抗体展示在293T细胞表面并被流式细胞仪检测到。据此计算,本研究所建立的RA患者特异性的全长人源抗体库的可表达库库容量可以达到8.04×1010[(1.14×106×70%)×(1.12×105×90%)],可以满足高特异性、高亲和力抗体的筛选需要。应用此大容量RA抗体库,有希望筛选获得针对RA的特异性全长抗体,从而推动RA的生物治疗。