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随着社会的发展,人们愈来愈重视身体健康,作为一类与基因表达具有密切关系的病症,癌症的早期诊断具有十分重要的意义。肿瘤标志物是指核酸、蛋白质等能够对癌症起到指示作用的相关物质。因此,实现对这些标志物的灵敏检测对于癌症早期诊断、预防及靶向治疗具有十分深远的意义。荧光生物传感器作为一种成熟的检测方法,具有简单、快速且稳定等特点,在癌症检测及临床医学等领域都展现了其独特的优势。本文利用DNA独特的识别能力、可调控性等诸多生物学特性,将酶辅助的信号放大策略与荧光生物分析传感检测方法相结合,建立了多种荧光生物传感体系并用于核酸的灵敏检测。本文中将研究工作分为以下几个部分:1.基于纳米金及纳米银簇的双重循环放大靶标检测本工作通过酶辅助的DNA链置换及滚环放大反应实现了对靶标的双重循环放大。实验应用两种检测方法,实现了对靶标的灵敏测定。报告探针上修饰的FAM荧光基团的荧光信号在与合成的纳米金反应靠近后,由于共振能量转移(FRET)使得自组装形成的分子信标荧光信号猝灭,在结合了靶标双重循环放大策略后,循环产物破坏了报告探针的发夹结构,荧光基团FAM远离纳米金,从而实现了荧光生物传感信号的恢复,该方法能够简单、快速且灵敏地对靶标进行有效的荧光生物传感检测。此外,该酶辅助的靶标双重循环放大策略又结合基于杂交链式放大反应原位生成纳米银簇的方法,在靶标存在的情况下,循环产物将引发发夹HP1与HP2之间相互打开发生杂交链式放大反应,并暴露出HP1、HP2中的富C序列,通过原位还原生成纳米银簇的方法,该方法也同样实现了对靶标的荧光生物传感检测。2.基于酶辅助DNA步行器的激酶检测及纳米线级联反应的靶标检测研究表明PNK与许多细胞活动的失调有关,最终会导致各种人类疾病,因此在生化研究中具有非常重要地位。在本工作中,首先通过构建一种由T4 PNK激活的DNA步行器。在PNK存在的情况下,结合核酸外切酶的酶解作用,形成自由的DNA摆臂,结合切刻内切酶的剪切作用,将修饰在纳米金表面的报告探针剪切,荧光基团FAM游离到溶液中远离纳米金,荧光信号恢复。除此之外,将纳米金表面报告探针的剩余序列作为下一步实验的引物,加入环状滚环模版,在聚合酶的作用下生成长的DNA纳米线。设计的H1、H2相继与DNA纳米线互补杂交,固定在纳米线上形成DNA纳米开关。在靶标mRNA存在的情况下,mRNA引发基于纳米线串联的DNA纳米开关级联放大反应,使得H1中的荧光基团与猝灭基团远离,荧光传感信号恢复。3.基于超支化等温扩增策略辅助的多位点链置换放大反应用于microRNA的超灵敏检测miRNA在多种癌症中均存在过度表达的情况。本次实验将miRNA与滚环模版结合,在酶辅助作用下引发了超支化等温扩增,反应生成大量不同长度的单链DNA。生成的DNA序列提供了多个链置换反应位点,与实验设计的FAM修饰的发夹HP1部分杂交,HP1发夹结构打开,将其5’粘性末端暴露出来。随后加入3’末端修饰有5-羧基四甲基罗丹明N-琥珀酰亚胺酯(TAMRA)标记的HP2,HP2将HP1从超支化滚环放大产物中置换出来,二者形成荧光信号双链体从而使FAM与TAMRA紧密靠近,发生荧光共振能量转移(FRET),从而避免了假阳性信号以及系统误差。这种简单快速的荧光生物传感方法实现了对miRNA的灵敏检测。