当植物吸收的光能过剩超过其电子传递所需时,过剩光能便会造成光合效率和光合功能的降低,严重时还会发生光氧化破坏。植物在长期的进化过程中形成了多种光保护机制,可将过剩激发能对光合机构的损伤减小到最低程度,其中叶黄素循环被认为在植物防御光氧化破坏中起着重要作用。所谓的叶黄素循环是指植物吸收的光能过剩时,双环氧的紫黄质(V)在紫黄质脱环氧化酶(VDE)的催化下,经过中间物单环氧的花药黄质(A)转化为无环氧的玉米黄质(Z);在暗处,则在玉米黄质环氧化酶(ZE)的作用下朝相反方向进行,将Z经A重新环氧化为V,形成一个循环。其中紫黄质脱环氧化酶(VDE)和玉米黄质环氧化酶(ZE)是该循环的关键酶。因此,弄清叶黄素循环的功能以及该循环的调控机理具有非常重要的意义。本文以小麦(旱丰9703)为材料,利用RT-PCR克隆了小麦紫黄质脱环氧化酶基因(WVDE)和玉米黄质环氧化酶基因(WZE),并分析了两个基因在小麦中的表达特征。构建了WVDE和WZE基因反义表达载体,并转化烟草,探讨了转基因烟草耐低温弱光和强光胁迫能力的变化。主要结果如下:1、根据已知序列设计特异引物,通过RT-PCR的方法从小麦叶片中克隆了小麦紫黄质脱环氧化酶和玉米黄质环氧化酶基因的中间片段序列。2、Northern杂交结果表明,WVDE表达量随强光和低温弱光处理时间的延长逐渐增大,6小时达到最大,之后逐渐稳定。WZE的表达趋势与WVDE的相似。不同光强、不同温度条件下WVDE和WZE表达趋势基本相同,说明WVDE和WZE在RNA水平的表达不受温度和光强的影响,而是受到内生节律的调控。3、将获得的小麦紫黄质脱环氧化酶基因和小麦玉米黄质环氧化酶基因分别与含有35S启动子的PBI121载体重组,构建了反义表达载体,利用农杆菌介导法转入烟草中,获得了转基因烟草。在低温弱光及强光胁迫条件下,依赖叶黄素循环的NPQ能够耗散过剩激发能,而转WVDE基因烟草比野生型耗散能力下降;强光处理过程中,与野生型相比转基因烟草的Fv/Fm降低更明显,且野生型的Fv/Fm恢复较快,转基因植株恢复较慢。低温弱光处理时,野生型和转基因株系Fv/Fm降低程度要小于强光胁迫,但总的变化趋势基本相同,这表明WVDE的抑制加重了PSII的光抑制程度,与野生型相比,转基因烟草的PSII反应中心受伤害较严重;强光胁迫6 h和12 h,野生型和转基因烟草的放氧速率降低非常显著,低温弱光处理6 h和12 h,野生型和转基因烟草的放氧速率都降低,但下降程度不如强光处理下的明显。这表明由于VDE的表达抑制降低了低温弱光和强光胁迫下放氧复合体的稳定性,使光合机构所受到的伤害加重;对野生型和转WZE基因烟草进行同样的强光和低温弱光胁迫处理,但两者之间似乎差别不大。4、对转WVDE基因植株和野生型烟草的幼叶与成熟叶分别进行northern杂交分析,结果显示VDE基因在烟草幼叶当中的表达水平要比成熟叶的高。进一步测定强光胁迫条件下幼叶与功能叶的光合和荧光参数,幼叶受强光胁迫的影响要比功能叶小的多。膜脂测定结果显示,幼叶当中不饱和脂肪酸的含量要稍高于功能叶,或许这也是导致幼叶的抗光氧化能力高于成熟叶的原因之一。