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应用ISSR标记对6个养殖群体的凡纳滨对虾的遗传多态性和亲缘关系进行分析,比较群体间、群体内的遗传差异。通过人工浸泡感染WSSV,比较分析6个养殖群体的凡纳滨对虾的累计死亡率、抗病力免疫指标变化(血细胞密度THC、血细胞酚氧化酶PO活力、血清蛋白质含量、一氧化氮合酶),以期了解这6个养殖群体对虾对WSSV敏感性差异。实验内容及结果如下:
以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的基因组DNA制备ISSR-PCR模板。采用单因素分析结合正交优化方法,对聚合酶链式反应(PCR)体系中模板DNA浓度、Mg2+浓度、dNTP的用量、Taq酶的含量以及退火温度梯度进行试验,筛选出清晰、多态性高可重复性好的ISSR引物的PCR反应条件。用100个ISSR引物进行了PCR扩增,筛选出效果较好的15个引物。
应用微卫星间隔序列扩增多态性DNA(ISSR)标记技术对凡纳滨对虾6个不同养殖群体遗传多样性和遗传分化进行研究。筛选出15种SSR引物对180个个体进行检测,应用POPGENE软件和MEGA软件对结果进行处理。结果共得到212个可重复的位点,其中多态位点185个,多态百分率为87.26%。各群体的多态位点百分率(PPB)为64.15%-68.40%,平均为66.26%。国联群体最高,其次是886群体和学生自制群体,最低是李小飞群体。Shannon指数和Nei指数均反映出对虾各群体群具有较高的遗传多样性。Shannon指数为0.4433,各群体Shannon指数在0.3681~0.3817之间,Nei指数为0.2953,各群体Nei指数在0.2487~0.2619之间。运用POPGENE得出群体内遗传变异(86.00%)大于群体间(14.00%)的结论。群体间的遗传分化系数为0.1400。对虾群体间的基因流为3.0713,遗传相似度平均为0.9340,遗传距离平均为0.0660。根据遗传距离聚类分析,应用MEGA软件得出遗传发生树。这6个群体明显分为两大支,李小飞群体和886群体之间的遗传距离最小,亲缘关系最近,首先聚在一起,旺意群体和国联群体两群体聚在一起后,又与陈子腾群体聚为在一起;这三个群体然后与学生自制群体聚在一起,最后才与群体李小飞群体和886群体聚在一起。
浸泡感染WSSV后测定各群体的凡纳滨对虾累积死亡率和感染WSSV过程中对虾在不同时间点的免疫学因子(THC、、血浆蛋白含量、血细胞总PO活力NOS活力等)的变化,结果得到:6个不同养殖群体对虾的死亡率从20%~62.5%。各个群体的对虾的免疫指标变化整体上趋于一致的同时也表现出不同养殖群体之间一定的差异性。来自于陈子腾养殖群体的对虾不仅有些免疫因子的变化趋势不同,而且变化幅度也不同,揭示养殖群体之间的对虾对WSSV敏感存在差异性。