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目的探讨白藜芦醇对人脑胶质瘤裸鼠原位移植模型的生存状况的影响及如何通过靶向周细胞对胶质瘤血管生成发挥抑制作用,为白藜芦醇的进一步开发及临床应用提供实验依据。方法1.培养稳定的U87胶质瘤细胞,建立人脑胶质瘤裸鼠原位移植模型,随机分为2组:(1)RES药物治疗组;(2)CMC溶剂对照组,每组均为12只。模型建立成功1周后,开始给药:RES组,灌胃给RES 40mg/(kg·d);CMC组,按照0.2ml/(20g·d)等体积灌胃0.5%CMC。以上两组连续给药4周。2.每隔5天测量一次体重,观察生命体征及模型动物生存状况。直到裸鼠出现恶病质状态处死裸鼠,采集标本,并绘制生存曲线。3.计算两组裸鼠原位移植肿瘤的大小,并观察肿瘤细胞的病理形态。4.分别采用CD34、α-SMA标记肿瘤微血管内皮细胞和周细胞,通过免疫组织化学方法检测并分析移植瘤中微血管密度(Microvessel density,MVD),即CD34+-MVD和微血管周细胞数密度(microvascular pericyte number density,MPND)。5.计算CD34+和α-SMA+免疫组化染色反应分数(immunoreactive score,IRS),并比较两组的差异。6.运用透射电子显微镜观察原位移植胶质瘤微血管中周细胞超微结构的改变;采用国际通用的细胞立体计量学的点分析法,测定分析周细胞中的线粒体的体密度(volume density,Vv)、比表面(specific surface,δ)、比膜面(specific membrane,δm),并比较两组的差异。结果1.成功建立人脑胶质瘤裸鼠原位移植模型2.体重变化图及生存曲线统计数据并绘制体重变化图,结果显示治疗组裸鼠体重在白藜芦醇治疗期间及治疗结束后,体重呈现稳步上升趋势;溶剂对照组的体重在实验的前期呈现大体微小波动,但总体呈现下滑趋势。经SPSS统计结果发现,治疗组(16.62±1.59),对照组(16.74±1.49),p>0.05,两组体重变化没有差异性。统计分析两组实验动物的生存时间,结果显示经过白藜芦醇治疗后两组胶质瘤原位移植造模裸鼠的生存时间差异很大,对照组为(53.41±11.62),白藜芦醇治疗组为(71.67±20.35),差异具有统计学意义(P<0.05)。植物抗肿瘤药物虎杖提取物白藜芦醇可以延长荷瘤裸鼠的生存时间,但对其体重的影响不明显。3.肿瘤体积及细胞形态计算两组肿瘤体积发现,白藜芦醇治疗组肿瘤体积明显减小,甚至消失。统计分析结果提示,溶剂对照组(67.60±34.22),白藜芦醇组为(18.27±22.45),差异具有统计学意义(P<0.05)。病理切片显示对照组肿瘤凸出脑白质,侵袭脑白质及脑骨质,肿瘤占位现象明显,脑内部中线位置向对侧偏移严重,接种肿瘤对侧脑组织受压严重变形,失去原本结构位置;治疗组脑组织轮廓正常,结构正常,大部分肿瘤减小,或消失,未给正常脑组织造成明显压迫或破坏原有脑组织结构。HE染色结果发现胶质瘤呈浸润性生长,胶质瘤细胞具有细胞异型性和结构异型性表现为:细胞大小不一,形态各异,有梭形、椭圆形、毛毛虫形等,胞浆呈现混合染色;细胞核畸形,核大深染,核质比例增高,核分裂象增多,可见巨核、多核或奇异核等病理性核分裂象。部分白藜芦醇治疗组肿瘤HE染色可见栅栏样肿瘤性坏死区,内见大量碎片状细胞核。植物抗肿瘤药物虎杖提取物白藜芦醇可以减小裸鼠原位移植胶质瘤体积,引起栅栏样坏死。4.微血管密度及MPND微血管密度计数统计结果提示,溶剂对照组的CD34+-MVD(34.00±2.70),白藜芦醇治疗组的结果为(25.43±1.54),差异具有统计学意义(P<0.05)。统计周细胞覆盖率发现,溶剂对照组MPND(14.40±0.95),白藜芦醇治疗组为(16.12±1.60),数量明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。植物抗肿瘤药物虎杖提取物白藜芦醇可以减低肿瘤微血管密度,提高周细胞肿瘤血管周细胞覆盖率。5.免疫染色反应分数分析两组免疫反应分数发现,溶剂对照组CD34染色IRS和α-SMA染色IRS分别为(8.36±1.90)和(6.91±1.63),白藜芦醇治疗组结果明显降低分别为(5.55±1.50)和(4.58±1.14),差异具有统计学意义(P<0.05)。植物抗肿瘤药物虎杖提取物白藜芦醇可以降低肿瘤血管内皮细胞和周细胞的免疫反应分数。6.周细胞超微结构观察并比较两组透射电镜结果发现,治疗组周细胞骨架紊乱,周细胞伪足少,凸起少,胞浆局限,细胞旁空间扩大;出现染色质浓缩、边际现象;胶原纤维减少,排列紊乱;高尔基体数量较少,靠近血管的位置分泌小泡较少,细胞连接方式单一;线粒体数量减少、结构肿胀不规则、空泡化,嵴和膜形态不规则变短变少甚至消失;周细胞的内质网变短,部分核糖体脱落或缺失;自噬体形成。对照组周细胞触足较多,凸起丰富,并互相交叉重叠,胞浆丰富,呈弥漫式分布在血管内皮细胞周围;线粒体丰富,胶原纤维丰富,周细胞之间连接紧密,呈现齿状连接、缝隙连接、桥粒连接和融合连接等多种复合连接方式;高尔基体丰富,分泌小泡丰富,内质网较长,核糖体丰富。采用立体计量学的点分析法分析周细胞线粒体功能结果提示,治疗组的Vv、δ、δm分别为(22.00±1.68)、(2.41±0.50)、(40.10±2.26),对照组的Vv、δ、δm分别为(37.70±3.03)、(1.20±0.60)、(43.75±1.19),比较两组的差异,白藜芦醇治疗组Vv和δm明显降低,δ明显增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。植物抗肿瘤药物虎杖提取物白藜芦醇可以引发周细胞骨架紊乱,连接方式单一;周细胞伪足、胶原纤维、高尔基体及分泌小泡减少;线粒体肿胀、空泡化,数量减少伴功能减低。结论1.口服植物抗肿瘤药物虎杖提取物白藜芦醇具有增加人脑胶质瘤原位移植荷瘤裸鼠的生存时间,减小肿瘤体积,抑制胶质瘤生长的作用。2.虎杖提取物白藜芦醇可引发周细胞线粒体等超微结构紊乱和功能减低;促使周细胞自噬体形成;提高周细胞覆盖率,降低微血管密度及内皮细胞和周细胞免疫反应分数发挥抑制胶质瘤裸鼠原位移植胶质瘤血管生成的作用,进而产生抗胶质瘤作用。