天麻(Gastrodia elata Bl.)作为一种食药同源的植物,既有改善心脑血管功能、抗衰老、抗癌等药用价值,又有补充微量元素和氨基酸的营养价值,是我国重要的中药材,其国内外需求量较大,所以在市场上一直存在供不应求的状况。而天麻是兰科植物中高度退化,无法靠自身营养萌发,在生活史的后期也没有可以用来吸收外界营养的根,所以在萌发菌的帮助下才能完成其种子的萌发,之后的正常生长则需与蜜环菌共生。萌发菌和蜜环菌在天麻的生长过程中起着决定性的作用,两菌协同促进其萌发和生长。目前在天麻的种植中,两菌退化、易污染等问题限制着天麻产业的发展,而对于本文重点研究的对象天麻萌发菌小菇属(Mycena)真菌来说还存在着菌种混乱、分离困难、菌株难以鉴定、萌发菌培养期长等问题。为了解决以上问题,本课题进行高通量测序、小菇属特异性引物设计、培养基优化和真菌分离四项研究,得到了以下结论:1、通过高通量测序探明了天麻萌发初期三个阶段与其生活土壤的菌群存在一定的差异。四组样本有239个OTUs存在差异,其中有16个属共同存在于四组样本,原球茎菌群结构较为复杂,只分布于原球茎的有8个属,共同存在于原球茎和米麻的有7个属,而同时存在于三个阶段组织的菌株仅有1个。小菇属真菌在所测样本中分布很少,在各组的分布比例随天麻原球茎的生长减少,在原球茎样本占到1.5%的比例,在米麻样本占到0.05%的比例,在土壤样本中存在极其微量,而在白头麻样本中未检测到,所以分离时需要大量的分离材料且需要对分离材料有所选择。这些结论为下一步有针对性的寻找分离材料奠定了基础。2、设计了5对小菇属特异性引物,对它们的特异性、灵敏度和实际运用能力进行了评估。其中,特异性较好的四对引物分别为M52-2、M22-3、M11-4、BZ-5,在来自三个门、45个科的125个测试菌株范围内能测出的菌株数量分别为2.4%、6.4%、4.0%和7.2%;灵敏度较好的M22-3和BZ-5能检测到菌丝在土壤中的最小浓度均为0.033%;实际用总DNA检测后显示M22-3和BZ-5能够从样本总DNA中检测出小菇属真菌。特异性引物的设计为菌种的鉴定提供了一种快速而又简便方法,可以改善菌株难以鉴定、菌种混乱的问题。3、采用均匀设计对小菇一级种的合成培养基和天然培养基进行设计,并采用二次多项式逐步回归对合成培养基进行优化,得到了能使小菇快速生长的培养基配方。合成培养基培养小菇21天后,直径优化配方得到直径为69.0cm,生物量优化配方得到生物量为0.2685g;而天然培养基均匀设计配方培养15天的后,直径最大的配方得到直径为74.7cm,生物量最大的配方得到生物量为0.3653g。探讨对小菇生长影响较大的几种营养因子之间的交互作用,显著影响小菇菌落直径的因子主要为甘氨酸、磷酸二氢钾、可溶性淀粉、酵母膏和蛋白胨,其中磷酸二氢钾与可溶性淀粉、酵母膏与蛋白胨,两组营养元素有强烈的交互作用;影响小菇菌落生物量的因子主要为甘露醇、七水硫酸镁、蔗糖、甘氨酸和蛋白胨,其中蔗糖与甘露醇、蔗糖与甘氨酸、七水硫酸镁与蛋白胨、七水硫酸镁与甘露醇,四组营养元素有强烈的交互作用。培养基的优化为研究小菇发菌期培养基提供了一定的理论基础。4、最后对采集样本进行了内生菌分离,得到259株真菌,进行形态合并、选择后测序得到65个OTUs,这些菌株来自3个门39个科,其中Ascomycota(93.2%)和Basidiomycota(6%)占比最大,Mucoromycota占比在1%以下。在真菌分离中得到了一些高通量测序中注释到的真菌,分别为Mariannaea(3.0%)、Trichoderma(8.3%)、Clonostachys(4.5%)、Fusarium(15.8%)属的真菌,推测它们可能是一些潜在的萌发菌株,后期可进行萌发试验来验证。总之,通过以上研究我们期望可以缩短小菇的生长时间,解决萌发菌发菌期长的问题,并且为快速定位、分离小菇奠定基础,推动未来天麻产业的发展。