第一部分RGMa在难治性TLE患者及动物模型脑组织中的表达目的：苔藓纤维出芽是颞叶癫痫的一个常见组织病理学特征，可导致海马突触重组，在癫痫的发病机制中发挥着重要作用。RGMa（Repulsive Guidance Molecule a）是一种排斥性轴突导向因子，主要起抑制轴突生长的作用。本研究首先检测了RGMa在药物难治性颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy，TLE）患者脑组织及氯化锂-匹罗卡品（LiCl-PILO）癫痫大鼠模型中的表达，以初步探讨RGMa在TLE发生发展中的可能作用。方法：1.23例难治性TLE患者颞叶皮质和10例非癫痫对照组颞叶皮质随机取自课题组所建立的耐药性癫痫患者术后脑组织标本库。2.63只成年雄性SD大鼠随机分为癫痫组（n=54）和对照组（n=9），癫痫组又分为6个亚组，即6h组，72h组，7d组，14d组，30d组，60d组（每组n=9），癫痫组大鼠给LiCl-PILO造模。3.用免疫荧光双标、免疫组化和免疫印迹方法检测RGMa在颞叶癫痫患者及癫痫大鼠脑组织中的表达。结果：1.免疫组化提示，RGMa蛋白主要在颞叶癫痫患者及对照患者颞叶皮质神经元的细胞浆和细胞膜中表达。RGMa在TLE患者脑组织中的免疫组化平均光密度值（OD）显著低于对照组（p<0.05）。免疫荧光双标结果提示RGMa主要在神经元中表达，而不在胶质细胞中表达。免疫印迹结果显示RGMa在对照组表达呈强阳性，而在TLE组中则为弱阳性， TLE患者颞叶皮质RGMa表达显著低于对照组（p<0.05）。2.在氯化锂-匹罗卡品癫痫大鼠及对照组海马各区及海马周围皮质中均可见RGMa免疫组化阳性染色，海马齿状回区、CA1区、CA3区阳性最明显。海马组织的RGMa免疫组化平均OD值在大鼠造模后各时间点呈逐渐降低的趋势。免疫荧光双标结果提示RGMa在大鼠海马及周围皮质神经元中表达，而不在胶质细胞中表达。免疫印迹结果显示，与对照组相比，RGMa在潜伏期及慢性期表达均降低。与对照组相比，RGMa在癫痫各时间点组大鼠海马的表达均有差异（p<0.05）。结论：RGMa在难治性颞叶癫痫患者及氯化锂-匹罗卡品大鼠癫痫模型脑组织中表达均下调，提示RGMa可能参与了颞叶癫痫的发生发展。第二部分慢病毒转染海马过表达RGMa对癫痫大鼠行为学的影响目的：为进一步探讨RGMa在癫痫发生发展中的作用，我们构建了过表达RGMa基因的慢病毒载体，通过海马立体定位注射以增加大鼠海马RGMa表达，观察了过表达RGMa对LiCl-PILO癫痫急性模型、慢性模型以及戊四氮化学点燃模型大鼠行为学的影响。方法：1.成年雄性SD大鼠随机分为三组：海马立体定位注射慢病毒空载体组（LV-empty）,海马立体定位注射慢病毒RGMa组（LV-RGMa），未注射组（control）。分别用免疫荧光、免疫印迹方法检测转染效率。2.急性癫痫动物模型行为学观察：造模前成年雄性SD大鼠随机分为Control组、LV-empty组及LV-RGMa组。大鼠双侧海马注射慢病毒一周后造模，LiCl-PILO造模之后2h内分别记录每30分钟间隔的Racine评分以及大鼠从注射PILO到首次出现IV级及以上行为的发作时间（癫痫发作的潜伏期）。3.点燃动物慢性期自发性癫痫发作行为学观察：大鼠在LiCl-PILO造模达到SE标准后随机分为三组：慢病毒空载体海马立体定位注射组（EP+LV-empty）、慢病毒RGMa海马立体定位注射组（EP+LV-RGMa）、未注射组（EP），持续视频监测记录大鼠癫痫自发性发作（SRS）的频率及Racine评分。4.戊四氮（PTZ）化学点燃模型行为学观察：成年SD大鼠随机分为LV-empty组和LV-RGMa组，慢病毒注射后3天，每天给予阈下剂量的PTZ注射后，观察并记录癫痫发作严重程度评分及从注射PTZ第一天至癫痫成功点燃的时间（潜伏期）。结果：1.慢病毒RGMa双侧海马立体定位注射后，海马RGMa表达升高。与相应时间点对照组相比，RGMa的OD比值在慢病毒注射后3d组,7d组,35d组显著升高（p<0.05），7d组升高最明显。免疫荧光结果显示EGFP阳性表达位于海马，尤其是齿状回区。2.匹罗卡品注射后，大鼠癫痫发作的平均Racine评分逐渐升高。在每30min时间间隔内，LV-RGMa组的平均癫痫发作评分比LV-empty组低（p<0.05）。与LV-empty组相比，LV-RGMa组癫痫发作的潜伏期显著延长（p<0.05）。3. LiCl-PILO诱导SE后慢性期内（21-35d），与LV-empty相比，LV-RGMa组平均SRS频率减少（p<0.05），平均Racine评分降低（p<0.05）。4.在戊四氮点燃过程中，与LV-empty组比，LV-RGMa组平均点燃潜伏期延长（p<0.05），平均癫痫发作评分降低（p<0.05）。结论：1.慢病毒RGMa海马立体定位注射后可增加海马RGMa的表达，转染在注射后3d有效，持续至35d。2.慢病毒介导的海马RGMa过表达能减轻LiCl-PILO诱导癫痫发作的严重程度并降低癫痫发作的易感性。3.海马RGMa过表达能减少LiCl-PILO癫痫模型慢性期自发性癫痫发作的频率并减轻发作严重程度。4.海马RGMa过表达延长PTZ点燃癫痫的潜伏期并减轻发作严重程度。第三部分RGMa对癫痫大鼠苔藓纤维芽生的影响及可能机制目的：为了解RGMa对癫痫动物海马苔藓纤维芽生的影响，我们在LiCl-PILO大鼠造模后35天进行了硝酸银染色以观察RGMa过表达对苔藓纤维出芽（MSF）的影响，并同时检测了与轴突生长密切相关的RhoA、Cdc42及Rac1的表达，以探讨RGMa影响MSF的可能机制。方法：1.成年雄性SD大鼠造模前随机分为正常对照组（control）和癫痫组，癫痫组又根据造模后海马立体定位注射试剂的不同分为：未注射组（EP）、慢病毒空载体组（EP+LV-empty）及慢病毒RGMa组(EP+LV-RGMa)。2.用Timm组织化学染色方法观察各组MSF并对MSF的严重性进行Timm评分。3.用蛋白免疫印迹方法检测造模后35d大鼠海马RhoA、Cdc42及Rac1的表达。结果：1.EP+LV-empty组海马齿状回颗粒细胞上层见明显的Timm颗粒，与control组比较，EP+LV-empty组平均Timm评分显著升高（p<0.05），但EP+LV-RGMa组平均Timm评分较EP+LV-empty组显著降低（p<0.05）。2.蛋白免疫印迹实验结果显示，与control组相比，EP组、EP+LV-empty组及EP+LV-RGMa组RhoA的平均OD比值明显升高，与EP+LV-empty组比较，EP+LV-RGMa组OD值显著升高（p<0.05），而EP组和EP+LV-empty组之间没有差异(p>0.05)。3.同时，我们还发现，与control组比较，EP组和EP+LV-empty组Cdc42及Rac1表达显著升高（p<0.05），EP+LV-RGMa组Cdc42及Rac1的表达较EP+LV-empty组降低（p<0.05），而EP组和EP+LV-empty组之间没有差异(p>0.05)。结论：1.慢病毒介导海马RGMa过表达能减轻癫痫大鼠海马的苔藓纤维出芽。2.慢病毒介导海马RGMa过表达调节了海马RhoA，Cdc42及Rac1的表达，可能与RGMa影响苔藓纤维出芽有关。第四部分海马RGMa过表达对大鼠神经元兴奋性的影响目的：为了研究RGMa在癫痫发作中的可能机制，我们采用无Mg2+人工脑脊液诱导脑片放电模型研究了过表达RGMa对海马神经元兴奋性的影响。方法：1.SD大鼠随机分为三组：海马注射慢病毒空载体组（LV-empty）,海马注射慢病毒RGMa组（LV-RGMa），未注射对照组（Control）。病毒注射后1周处死动物用于制备脑片。2.用全细胞膜片钳技术记录0Mg2+人工脑脊液（ACSF）诱导各组脑片海马CA1区锥体细胞动作电位（AP）、微小兴奋性突触后电流（mEPSC）及诱发兴奋性突触后电流（evoked EPSC）。结果：1.0Mg2+ACSF诱发的AP频率在LV-RGMa组显著低于LV-empty组或control组（p<0.05）；mEPSC的频率和幅值在LV-RGMa组显著低于control组或LV-empty组（p<0.05）。2.与control组和LV-empty组相比，LV-RGMa组的NMDA/AMPA电流比值显著降低（p<0.05），且LV-RGMa组的NMDA介导EPSCs幅值显著降低（p<0.05）而AMPA介导EPSCs幅值没有显著差异（p>0.05）。结论：1. RGMa过表达能抑制0Mg2+ACSF诱导海马CA1区神经元的过度兴奋。2. RGMa过表达能选择性抑制海马脑片NMDAR介导的突触电流。