目的干眼(dry eye,DE)是眼表常见疾病之一,主要表现为眼部不适,视觉质量下降,伴有泪液渗透压升高和眼表炎症。炎症、性激素分泌失衡、神经机能障碍、细胞凋亡及氧化应激共同参与干眼的发病机制。目前,人工泪液治疗干眼虽有一定疗效,但停药后易复发。局部应用抗炎药物可抑制炎症因子,减轻干眼症状,但长期使用存在毒副作用。如何有效的控制甚至逆转干眼,寻找一种安全有效的药物迫在眉睫。研究发现,氢气具选择性抗氧化作用,同时它可抑制炎性因子的释放,具有抗炎作用。富氢盐水(hydrogen-rich saline,HRS)是将氢气在0.4MPa高压下溶于生理盐水,达到饱和浓度为0.6mmol/L,它在多种疾病的动物模型中均表现出明显抗炎作用。本实验使用HRS滴眼及腹腔注射两种途径干预东莨菪碱诱导的大鼠干眼模型,检测各组大鼠的临床指标、角结膜组织病理变化、细胞凋亡情况、鳞状上皮化生程度以及炎症相关因子核因子-kB(nuclear factor-kB,NF-kB)的表达,探讨HRS对大鼠干眼眼表是否具有保护作用。方法1.采用随机数字表法将30只6周龄健康Wistar大鼠分为6组,分别为正常组(A)、干眼组(B)、HRS滴眼组(C)、生理盐水(normal saline,NS)滴眼组(D)、HRS腹腔注射组(E)、NS腹腔注射组(F),每组5只(10眼)。后五组后肢皮下注射3mg·mL-1氢溴酸东莨菪碱建立干眼模型,每天注射4次(9点、12点、15点、18点),每次0.5ml,左右两侧交替进行。对C组和D组分别用HRS、NS点眼,每小时点眼1次,每天点眼9次(8点半-16点半);E组和F组按5ml·kg-1每天分别腹腔注射HRS、NS 1次(18点半),连续28天。2.用药前及用药后7、14、21、28天分别对各组大鼠行泪液分泌试验(SchirmerⅠtest,SⅠt)、泪膜破裂时间(break-up time,BUT)和角膜上皮荧光素钠染色评分,记录数据。3.用药后28天,颈椎脱臼法处死大鼠,取整个眼球,石蜡切片后行HE染色,光镜下观察各组大鼠角结膜组织学变化。4.行过碘酸-雪夫(periodic acid schiff stain,PAS)染色,光镜下观察各组大鼠结膜杯状上皮细胞形态,并计数光镜下每高倍视野杯状细胞数目。5.原位末端转移酶标记(TUNEL)法,荧光显微镜下检测各组大鼠角结膜凋亡情况,并计数荧光显微镜下每高倍视野细胞凋亡个数。6.行免疫组化染色,光镜下观察各组大鼠角结膜组织中角蛋白10(keratin 10,K10)的表达,评估鳞状上皮化生程度。7.取各组大鼠角结膜组织,采用免疫印记法检测各组大鼠角结膜组织NF-kB的表达。结果1.SⅠt:比较各组大鼠造模7天的SⅠt差异具有统计学意义(F=2.897,P<0.05),干眼组SIt值与正常组相比下降(P<0.05)。比较各组大鼠造模14天SⅠt值差异具有统计学意义(F=5.194,P<0.05),HRS滴眼组和HRS腹腔注射组SⅠt值均比干眼组升高(P<0.05);HRS滴眼组和HRS腹腔注射组SⅠt值分别比NS滴眼组和NS腹腔注射组升高(P<0.05);且HRS滴眼组和HRS腹腔注射组SⅠt值差异始终无统计学意义(P>0.05)。至28天始终保持稳定。2.BUT:比较各组大鼠造模7天BUT差异具有统计学意义(F=2.910,P<0.05),干眼组BUT值与正常组相比下降(P<0.05)。比较各组大鼠造模14天BUT差异具有统计学意义(F=3.894,P<0.05),HRS滴眼组和HRS腹腔注射组BUT值均比干眼组升高(P<0.05);HRS滴眼组和HRS腹腔注射组BUT值分别比NS滴眼组和NS腹腔注射组升高(P<0.05);且HRS滴眼组和HRS腹腔注射组BUT值差异始终无统计学意义(P>0.05)。至28天始终保持稳定。3.角膜上皮荧光素钠染色评分:比较各组大鼠造模7天的角膜上皮荧光素钠染色评分差异具有统计学意义(F=2.424,P<0.05),干眼组染色评分与正常组相比升高(P<0.05)。比较各组大鼠造模14天的角膜上皮荧光素钠染色评分差异具有统计学意义(F=16.487,P<0.05),HRS滴眼组和HRS腹腔注射组染色评分均比干眼组下降(P<0.05);HRS滴眼组和HRS腹腔注射组染色评分分别比NS滴眼组和NS腹腔注射组下降(P<0.05);且HRS滴眼组和HRS腹腔注射组染色评分差异始终无统计学意义(P>0.05)。至28天始终保持稳定。4.HE染色:光镜下观察,干眼组角膜上皮细胞分层模糊,排列不紧密,细胞体积较大,基底层细胞部分缺失,上皮表面细胞损伤脱落,靠近角膜表面逐渐变成鳞状上皮细胞。结膜上皮出现过度增生,角化增加,杯状细胞分布更靠近基底层细胞。HRS滴眼组和HRS腹腔注射组大鼠角结膜上皮均变平整规则,细胞层次减少,边界清晰,水肿减轻,组织增生减少。5.PAS染色:光镜下观察,干眼组大鼠结膜杯状细胞大小不均匀,靠近基底部,个数减少。HRS滴眼组和HRS腹腔注射组均可见大鼠结膜杯状细胞大小趋于正常,个数增多。比较两组之间杯状细胞计数,差异无明显统计学意义(P>0.05)。6.TUNEL检测:荧光显微镜下观察,干眼组大鼠角结膜上皮凋亡细胞较正常对照组明显增多。HRS滴眼组和HRS腹腔注射组大鼠角膜上皮凋亡细胞较干眼组和NS干预组明显减少,细胞大小均匀,表层光滑。比较两组之间凋亡细胞计数,差异无明显统计学意义(P>0.05)。7.免疫组化染色:正常组大鼠角膜、睑结膜上皮均未见K10表达,穹隆部结膜可见K10弱表达。干眼组大鼠角膜上皮和穹隆部结膜K10表达强阳性,睑结膜未见明显K10表达。HRS滴眼组和HRS腹腔注射组大鼠角膜、穹隆部结膜上皮均K10表达明显减弱。8.免疫印记:干眼组角结膜组织NF-kB较正常组表达明显增多,HRS滴眼组和HRS腹腔注射组大鼠角结膜组织NF-kB表达较干眼组和NS干预组减少,且两组间差异不具统计学意义(P>0.05)。结论本实验采用HRS滴眼及腹腔注射两种途径干预东莨菪碱诱导的大鼠干眼模型,通过检测各组大鼠干眼的临床指标泪液分泌试验、泪膜破裂时间、角膜上皮荧光素钠染色评分,角结膜组织学病理改变、细胞凋亡情况、鳞状上皮化生程度以及炎症因子NF-kB的表达,发现HRS滴眼和腹腔注射均能改善干眼体征;使角结膜上皮增生减少,杯状细胞形态趋于正常;角结膜上皮凋亡细胞明显减少;角结膜鳞状上皮化生改善;角结膜组织NF-kB表达减少。综上所述,HRS可能通过抑制炎症反应来缓解东莨菪碱诱导的大鼠干眼眼表损伤,对干眼具有保护作用,有望成为治疗干眼的新型药物。