P53(Tumor suppressor p53,TP53,TRP53)是由17号染色体上的TP53基因编码的蛋白,对细胞生长、分化、代谢及机体免疫具有重要调控作用。P53功能异常与多种人类疾病相关,如P53功能缺失或异常对肿瘤的发生和发展具有重要的促进作用,因此P53主要被作为一种关键的抑癌基因进行研究。几乎在所有人类肿瘤中,P53都以不同形式处于失活或功能异常状态:一些肿瘤中P53发生失活突变从而丧失抑癌活性,甚至促进肿瘤生长转移;另外一些肿瘤中,虽然P53以野生型存在,但其活性被异常的负调控机制抑制。利用外来干预恢复P53信号通路的正常功能,一直是有吸引力的肿瘤治疗策略。P53野生型肿瘤并不罕见,多见于结直肠癌、淋巴瘤及部分肿瘤病毒(如人乳头瘤病毒HPV和Epstein-Barr Virus等)诱发的肿瘤。这些肿瘤中,如果恢复或增强野生型P53蛋白的活性,将在很大程度上抑制肿瘤的生长。本研究利用高通量筛选、计算机药物虚拟筛选和知识图谱等多学科技术手段的交叉应用,聚焦于筛选P53信号通路小分子激活剂,得到两种潜在的P53通路激活剂——Torilin和UNBS5162,并对其中比较具有成药潜力的分子UNBS5162进行了较为系统的分子作用机制研究。围绕P53信号通路激活剂的开发,本研究分别构建了基于靶点(野生型P53蛋白)的计算机药物虚拟筛选系统和基于生物学表型(P53转录活性)的荧光素酶高通量药物筛选系统,并将两种系统交叉应用于后续的化合物分子作用机制研究和药效验证。一方面,从计算机虚拟筛选系统出发,联合荧光素酶筛选系统的验证,发现天然产物Torilin能激活P53信号通路,实验证明Torilin能够提高野生型P53的稳定性,进而激活P53下游通路,抑制P53野生型肿瘤细胞的生长,并通过分子对接表明Torilin通过2-甲基-2-丁烯醇直接结合在P53的关键氨基酸位点Cys124上,维持P53稳定性构象。另一方面,从高通量系统中筛选得到了潜在的P53通路激活剂UNBS5162,实验验证其在细胞模型和异种移植瘤动物模型中显著抑制肿瘤生长。进一步的机制研究发现UNBS5162促进MDM2(P53的E3泛素连接酶)的降解,抑制P53的泛素化,稳定P53蛋白,提高肿瘤细胞内P53蛋白水平,诱导P53信号通路下游基因表达,从而通过促进细胞凋亡和阻滞细胞周期,抑制多种P53野生型肿瘤细胞的生长。随后利用团队成员构建的P53蛋白调控网络知识图谱分析了P53活性和稳定性相关的信号通路和节点分子,缩小研究范围,并利用计算机虚拟筛选系统协助探索了UNBS5162可能的直接作用靶点。Torilin通过直接结合稳定P53蛋白构象,UNBS5162通过影响P53翻译后修饰调控因子间接激活P53信号通路,是两种典型的P53信号通路激活策略,有应用于临床治疗的潜力,且可能协同作用,提高抑癌效果。该方向的探索将在后续的研究中继续进行。综上,本论文为了快速而全面地进行P53通路激活剂筛选,尝试建立了两种不同策略的药物筛选系统:(1)基于P53蛋白靶点的计算机虚拟药物筛选系统;(2)基于P53转录活性的荧光素酶高通量药物筛选系统。随后利用其筛选出潜在的P53通路激活剂,并探索性地交叉利用分子生物学、计算机科学和药学等学科的新兴技术手段,进行药物作用机制研究和药物靶点探索,为基于P53信号通路的药物筛选及开发,奠定了一定基础。