强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一种慢性、进行性、自身免疫性疾病,起病隐匿,多见于青少年,以中轴关节慢性炎症为主,主要侵犯骶髂关节、脊柱骨突、脊柱旁软组织及外周关节,并可伴发关节外表现。严重者可发生脊柱畸形和关节强直。也可累及内脏及其他组织的慢性进展性风湿性疾病,晚期常导致严重的脊柱和关节畸形。在我国,强直性脊柱炎患病率初步调查为0.25％,发病年龄通常在13～31岁,8岁以前及40岁以后发病者较少。本病患者男性明显多于女性,男女比例为5:1。由于AS的发病机制尚未完全清楚,单纯药物或手术治疗对病情改善效果并不十分理想,有研究提示基质金属蛋白酶3(MMP3)应被视为一个评估AS病情活动性的客观指标,进一步研究MMP3与AS密切联系的机理,为AS寻找新的诊治靶点成为新近国内外研究重点课题项目。　　 现有研究结果表明AS的脊柱可动关节和外周关节与类风湿性关节炎疾病早期有着相似的滑膜炎症状,出现局灶性的淋巴细胞和浆细胞积聚。伴随滑膜增生,血管翳的形成,造成软骨破坏和骨的侵蚀。而MMPs是一多效性细胞因子,影响多种类型细胞的增殖、生长、分化及凋亡,滑膜细胞也是MMPs信号的特异性靶细胞之一。因此有学者认为MMPs在维持骨关节炎(OA)患者的关节内环境稳定及关节软骨的修复机制中发挥重要作用。MMP3是对基质起广泛作用的一种蛋白酶,其活性表现为降解聚集的核心蛋白、软骨连结蛋白纤维结合素,以及Ⅳ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅺ型胶原蛋白。MMP3由成纤维细胞、滑膜细胞和软骨细胞分泌,被认为是导致软骨降解的最重要的蛋白酶。MMP3的过表达被发现存在于滑膜组织中,且滑液当中含有大量MMP3。　　 为进一步明确MMP3与AS患者发病之间的关系,本研究深入系统地研究了MMP3在AS中的表达变化及其调控机理。通过研究:(1)MMP3在AS患者血浆中的表达;(2)MMP3-RNA在AS患者单个核细胞的表达水平;(3)rhIL-10与IFN-γ对大鼠滑膜细胞株RSC-364增殖影响的实验研究;(4)MMP3在大鼠滑膜细胞株RSC-364表达水平的实验研究,进一步探索MMP3对AS病情分级的临床意义和表达的调节及影响,用以明确MMP3与AS病情发展的相关性。经过与对照组比较,实验结果提示血浆中MMP3的含量和单个核淋巴细胞的MMP3-RNA随着病程的加重而增加;大鼠滑膜细胞株RSC-364的MMP3表达和增殖实验结果显示,rhIL-10及IFN-γ重组的细胞因子均能有效地抑制炎性滑膜细胞的增殖,单药物作用时,其有效性与药物剂量和作用时间成正相关性,且两者协同作用时效果最佳;在MMP3的表达实验中,单药物作用时,药物剂量和作用时间与MMP3表达的量显著相关。两者联合作用时,药物剂量与MMP3表达的量显著相关,但药物作用时间的延长与MMP3表达的量无相关性。通过本课题实验,为AS的病因研究和寻找治疗途径和新的诊治靶点提供重要依据。　　 第一部分MMP3在AS患者血浆中的表达　　 目的：　　 研究基质金属蛋白酶3(MMP3)在不同临床分级(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级)阶段的强直性脊柱炎(AS),类风湿关节炎(RA),以及健康对照者中MMP3蛋白的表达,探讨MMP3在AS和RA病情分级中的临床意义。　　 材料与方法　　 筛选临床病例,AS患者18例,男性14例,女性4例。以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组患者血浆中MMP3的含量并与影像诊断学分期的(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级)阶段的强直性脊柱炎(AS)进行比较。　　 结果　　 AS不同临床分级(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级)患者和健康对照者血浆中的MMP3含量在各组间差异显著,有统计学意义(P＜0.05)。ASⅢ级表达最高(126±42ng/ml),ASⅠ级患者表达值(57±13 ng/ml)比健康对照组高,但低于其它组别,结果显示随着病程级别增大而MMP3含量增加。RA患者中MMP3表达量稍大于ASⅡ级患者,两者之间差异无统计学意义。　　 讨论　　 通过检测AS临床病情分级(ASⅠ、Ⅱ、Ⅲ级)患者血浆中的MMP3水平,提示其显著高于正常对照组,差异有统计学意义(P＜0.05),与病情发展程度呈正相关。通过血浆中MMP3水平的检测了解AS的发病程度,对于指导临床治疗有一定的价值。　　 第二部分MMP3-RNA在AS患者单个核细胞的表达水平　　 目的　　 观察基质金属蛋白酶3(MMP3)-RNA在不同临床分级(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级)阶段的强直性脊柱炎(AS),类风湿关节炎(RA)患者,及健康对照者中单个核细胞的表达,分析MMP3-RNA与疾病病程的相关性。　　 材料与方法：　　 取5ml经EDTA抗凝的外周血抽提单个核细胞,而后从中提取RNA,并采用RT-PCR的方法检测不同分级(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级)的AS和RA患者、健康对照者单个核细胞MMP3-RNA的表达水平。并经凝胶成像及分析系统扫描分析计算相对表达量。　　 结果：　　 MMP3-RNA在ASⅠ级(MIMP3-RNA灰度扫描值为3613.2±1443.9854)呈低表达,但略高于健康对照者;MMP3-RNA表达在ASⅡ期(MMP3-RNA灰度扫描值为4608.8±2018.3445)要高于ASⅠ期而低于ASⅢ级;ASⅢ级删P3表达(MMP3-RNA灰度扫描值为8777±3646.2949)最高,并且要远高于健康对照者。健康对照者与RA患者的MMP3-RNA均有表达,但RA组的表达量比健康对照组高。各组间差异有统计学意义(P＜0.05)。　　 结论：　　 MMP3-RNA在ASⅠ、Ⅱ、Ⅲ级中的表达呈递增现象,与AS病程及分级呈正相关,结果提示了MMP3-RNA的高表达与AS的发生发展相关。通过测定外周血单个核细胞中MMP3-RNA的水平能协助了解AS病情的变化,可作为判断患者临床分期及预后的重要参考指标。　　 第三部分rhIL-10与IFN-γ对大鼠滑膜细胞株RSC-364增殖影响的实验研究　　 目的：　　 探讨IL-1β诱导的大鼠滑膜细胞株RSC一364经rhIL-10与IFN-γ不同剂量及联合作用后,其细胞增殖的变化。　　 材料与方法：　　 经IL-1β(10ng/ml)刺激RSC-364滑膜细胞分为:rhIL-10处理组、IFN-γ处理组、rhIL-10与IFN-γ联合处理组及对照组,经24,48,72小时培养,倒置显微镜下观察和用CCK-8技术检测细胞增殖情况,在波长450nm测定其吸光度值。　　 结果：　　 (1)rhIL-10作用于滑膜细胞:A组:10μg/L;B组:40μg/L;C组:80μg/L,分别培养24,48,72小时,与对照组比较各组增殖明显受到抑制,并呈剂量和时间依赖性,各组间差异具有统计学意义(P＜0.05)。　　 (2)IFN-γ作用于滑膜细胞:A组:100×103U/L;B组:200×103U/L;C组:300×103U/L;分别培养24,48,72小时,与对照组比较其增殖明显受到抑制并呈剂量和时间依赖性,各组间差异具有统计学意义(P＜0.05)。　　 (3)rhIL-10与IFN-γ联合作用于滑膜细胞:A组:rhIL-10(10μg/L)+IFN-γ(100×103U/L);B组:rhIL-10(40μg/L)+IFN-γ(200×103U/L);C组:rhIL-10(80μg/L)+IFN-γ(300×103U/L),分别培养24,48,72小时,与对照组比较其增殖明显受到抑制,并呈剂量和时间依赖性,各组间差异具有统计学意义(P＜0.05)。组间比较以联合作用组其增殖抑制率更加明显(P＜0.05)。　　 结论：　　 不同剂量的rhIL-10与IFN-γ单独使用时,其有效性与作用时间和剂量浓度呈正相关。当两者联合使用时可见其抑制细胞增殖作用更显著。因此可以看出rhIL-10与IFN-γ均能作用于AS的炎性滑膜细胞,其作用机理可能与调控滑膜细胞过度增殖增生有关。　　 第四部分MMP3在大鼠滑膜细胞株RS0-364表达水平的实验研究　　 目的：　　 研究rhIL-10与IFN-γ作用于IL-1β诱导的大鼠RSC-364滑膜细胞时,MMP3蛋白表达的变化,探讨rhIL-10与IFN-γ及不同剂量对炎性滑膜细胞的有效作用和靶位。　　 材料与方法：　　 经IL-1β(10ng/ml)刺激的RSC-364滑膜细胞分为:IFN-γ处理组,rhIL-10处理组,rhIL-10与IFN-γ联合处理组,对照组。分别培养24,48,72d,时,倒置显微镜下观察细胞的增殖,并收集滑膜细胞培养上清液,用ELISA技术检测上清液中MMP3蛋白表达,结果进行统计学分析。　　 结果：　　 (1)rhIL-10作用于滑膜细胞:A组:10μg/L;B组:40μg/L;C组:80μg/L进行处理,分别培养24,48,72小时,与对照组比较其MMP3表达下降并呈剂量和时间依赖性,各组间差异具有统计学意义(P＜0.05)。　　 (2)IFN-γ作用于滑膜细胞:A组:100×103U/L;B组:200×103U/L;C组:300×103U/L进行处理,分别培养24,48,72小时,与对照组比较其MMP3表达下降并呈剂量和时间依赖性,各组间差异具有统计学意义(P＜0.05)。　　 (3)rhIL-10与IFN-γ联合作用于滑膜细胞,两种剂量的组合如:A组:rhIL-10(10μg/L)+IFN-γ(100×103U/L);B组;rhIL-10(40μg/L)+IFN-γ(200×103U/k);C组:rh IL-10(80μg/L)+IFN-γ(300×103U/L),分别培养24,48,72小时,与对照组比较其MMP3蛋白表达下降,并呈剂量依赖性,各组间差异具有统计学意义(P＜0.05)。组间比较以联合作用组其增殖抑制率更明显(P＜0.05)。rhIL-10与IFN-γ联合作用的A、B、C三组,每组MMP3的水平在24,48,72小时间差异均无统计学意义(P＞0.05)。　　 结论：　　 rhIL-10与IFN-γ分别显著降低滑膜炎性细胞上清液中MMP3的浓度,与作用的浓度和时间显著相关。当rhIL-10与IFN-γ协同作用时,与单个细胞因子作用相比,更有效地抑制MMP3的表达,但与作用时间无相关性。rhIL-10与IFN-γ联合应用有可能成为治疗AS的比较理想的方案。