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背景和目的:肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是当今世界上最为常见的原发性肝脏恶性肿瘤之一,其死亡率居于恶性肿瘤死亡率第二位,HCC的治疗除手术及常规化疗外,索拉菲尼是首个也是惟一一个用于HCC的靶向药物。尽管近年来研究人员致力于探索HCC的发生发展过程,但其具体的分子机制尚未阐明。因此,寻找HCC的生物标志物以及新型治疗靶点对HCC的治疗具有重要意义。Ras GEF(Ras guanine nucleotide-exchange factors)超家族的功能是调节Ras及小GTP酶的活性,进而影响肿瘤的增殖。Ras GRP1(Ras guanyl nucleotide-releasing protein 1)作为Ras GEF家族一员,在血液肿瘤、皮肤癌和结直肠癌中与肿瘤增殖相关,尚无Ras GRP1在肝癌中的相关研究,且机制并不清楚。本研究通过检测Ras GRP1在HCC组织中的表达及对患者预后影响,探索Ras GRP1在HCC中的作用机制,并对增殖产生的影响。方法:收集从2016年1月到2016年3月河南省肿瘤医院的24对新鲜HCC和癌旁组织标本,另收集2011年到2012年含有114对HCC癌和癌旁的组织并制作成组织芯片,经病理组织学证实诊断,收集其中具有非连续的106例患者的完整病例临床资料及患者预后信息。q RT-PCR检测Ras GRP1 m RNA表达水平;Western Blot方法检测临床标本中Ras GRP1蛋白的表达情况;免疫组化方法检测在组织芯片中Ras GRP1表达水平,并根据免疫组化染色情况进行评分;单因素及多因素Cox回归模型分析Ras GRP1表达水平与肝癌患者临床参数的关系,Kaplan-Meier方法分析Ras GRP1高表达对肝癌患者预后的影响;在Huh7和PLC细胞中si RNA下调Ras GRP1蛋白表达,HCCLM3和MHCC97L细胞中瞬时过表达Ras GRP1蛋白;选取增殖曲线、克隆形成、细胞周期及Ed U等指标研究Ras GRP1蛋白对HCC细胞增殖的影响;免疫共沉淀,免疫荧光,凝胶过滤色谱法等手段验证Ras GRP1与衔接蛋白Shc3(Src homolog and collagen homolog 3)之间的相互作用;应用质粒构建技术将Ras GRP1分成两个带有Flag标签的截短子D1(氨基酸序列470-607)和D2(氨基酸序列608-797),将D1和D2两个截短子分别与Shc3质粒共转染293T细胞,通过免疫共沉淀实验,包被Shc3抗体捕获带Flag标签的蛋白,检测Shc3与Ras GRP1的相互作用位点;采用泛素化相关实验,应用蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX)、蛋白酶体抑制剂MG132及泛素化特异性免疫共沉淀实验检测泛素化小分子Ubi的表达,探索Shc3对Ras GRP1蛋白表达水平的影响;通过检测Ras活性变化及对c-Jun通路激活情况探讨Ras GRP1与Shc3相互作用对增殖通路的影响。结果与结论:本研究发现RasGRP1在HCC组织中高表达,是HCC患者预后不良的独立危险因素。Ras GRP1降表达可抑制HCC细胞增殖,Ras GRP1高表达可促进HCC细胞增殖。在HCC细胞中,Ras GRP1与Shc3之间存在相互作用,Shc3通过抑制Ras GRP1蛋白泛素化降解而提高Ras/c-Jun通路激活水平来促进HCC细胞增殖,综上,Ras GRP1可能成为治疗HCC潜在的生物靶点。