环境内分泌干扰物（Environmental Endocrine Disruptors,EEDs）是一大类可以使人正常内分泌系统功能发生改变的化合物,包括洗涤剂、增塑剂、多氯联苯、药物、农药及塑料等以及其生产过程中的副产品和污染物及其降解产物。因其存在的普遍性和生殖毒性而引起了人们的特别关注。其中双酚A（Bisphenol A,BPA）和三氯生（Triclosan,TCS）,是最常见的两种EEDs。BPA是由丙酮和苯酚合成的2,2-双丙烷,主要作为生产环氧树脂和聚碳酸酯塑料的材料。TCS（5-氯-2苯酚）是一种广谱抗菌剂,广泛应用于家庭、医疗保健和个人护理产品中。BPA和TCS在人体多种体液和组织中可以检测到,包括尿液、血清、卵泡液、唾液、肝脏、脂肪和胎盘组织,大部分吸收的BPA和TCS,在24小时内通过尿液从体内完全清除。研究报道BPA和TCS的化学结构与17β-雌二醇（E₂）相似,可以通过与多种雌激素受体结合而表现出弱雌激素活性。然而目前关于BPA对人类生殖影响的人群流行病学研究的结果还存在很大争议。本课题组在2018年首次报道通过建立早孕小鼠染毒模型得出BPA通过ER/SGK1/ENa Cα通路,抑制ENa Cα的表达,从而影响小鼠子宫蜕膜化血管的生成并干扰子宫蜕膜化的进程,从而降低胚胎的种植率。已有研究结果显示TCS可能会导致小鼠胚泡植入中断,并改变胎盘雌激素合成,导致不良妊娠结局。由于缺乏有效的人类流行病学调查研究,TCS与女性生殖结局之间的关系还尚不清楚。体外受精-胚胎移植（in-vitro fertilisation and embryo transfer,IVF-ET）,既可以有效的治疗不孕不育,又能观察卵子成熟、受精、胚胎发育、着床、妊娠维持等女性生殖过程的关键环节,是评估EEDs对人类生殖早期的潜在影响的最佳体内模型之一。近期的一项人群流行病学研究报道,对256名妇女共进行了375个IVF新鲜胚胎移植周期（其中仅有7.1%的参与者因输卵管因素不孕）进行统计学分析后发现BPA暴露对卵巢促排卵结局、胚胎种植率、临床妊娠和活婴出生等IVF结局并没有不良影响,在这个研究中纳入人群的病因组成是杂乱多样,包括男性因素、女性因素（卵巢疾病、子宫疾病、子宫内膜异位症和卵巢储备功能降低）和不明原因不孕等,然而上述不孕因素均影响IVF的结局。因此,本研究的第一部分研究中以单纯输卵管因素不孕且行常规体外受精女性患者为研究对象,检测其取卵日尿液中BPA和TCS的浓度,采用多变量广义线性混合模型（Multivariable generalized linear mixed model）分别分析BPA和TCS与IVF病人促排卵结局和临床结局的相关性,探索BPA和TCS对女性早期生殖结局的影响。结合细胞缝隙连接（Gap junction,GJ）在卵子发育和成熟过程中发挥重要作用,而GJA1（Gap Junction Protein Alpha 1）作为一种跨膜蛋白是缝隙连接的重要组成蛋白。缝隙连接可以存在卵丘细胞最内层和卵母细胞之间,以及相邻的颗粒细胞之间。已有文献报道GJAl-/-的卵巢在体外进行培养,发现卵母细胞生长发生迟缓和卵泡生成受到抑制,GJA1基因已被确定为评估卵母细胞质量一个标志基因。因此,在第二部分研究中,收集取卵日卵泡穿刺液分离培养人颗粒细胞,分别建立BPA10ug/ml处理组和对照组细胞模型,经m RNA microarray生信分析,挑选差异基因GJA1,使用RT-PCR和Western blot分析GJA1分别在人颗粒细胞和KGN细胞的BPA处理后的表达情况;通过染毒小鼠卵巢免疫组化实验和人颗粒细胞免疫荧光实验分别在组织水平和细胞水平检测BPA处理后GJA1蛋白的表达,探索BPA暴露对GJA1表达的影响。使用ELISA分别检测不同浓度BPA暴露后人颗粒细胞和KGN细胞的培养上清中孕激素的表达,分析BPA对细胞合成激素功能的影响。在KGN细胞中,通过使用小干扰siRNA下调GJA1基因的表达后,分析P450Scc、3β-HSD和Star表达在m RNA水平和蛋白水平的变化,探索GJA1是否参与性激素合成关键酶的表达调控。采用焦磷酸测序,对GJA1启动子区的一段富含Cp G岛的序列进行测序,分别对BPA处理组和对照组的甲基化状态进行评估,探索甲基化是否参与调控BPA诱导的GJA1的表达。通过过表达miR-206,探索miR-206在KGN细胞中的功能性作用。最后,通过双荧光素酶报告基因实验,证明miR-206是否通过靶向结合GJA1 3′UTR区,使GJA1的表达发生改变,从而为BPA对卵子发育潜在毒性影响提供科学证据。第一部分BPA与TCS在不孕女性尿液中的浓度及其与IVF结局相关性研究研究目的:观察BPA和TCS在IVF管性不孕女性取卵日尿液中的暴露水平和分布情况,了解BPA和TCS对女性早期生殖过程中潜在的毒性作用。材料和方法:1、通过选择从2013年9月至2016年10月期间,在浙江大学医学院附属妇科医院生殖医学中心接受常规IVF-ET治疗的管性不孕的女性患者351例为研究对象。收集其取卵日手术前的尿液。2、采用高效液相色谱-质谱法（HPLC-MS）来检测尿液中BPA和TCS的水平和分布情况。测定结果进一步使用尿液中肌酐（Creatinine,Cr）的浓度进行标准化,Cr的测定使用碱性苦味算法,用比色法定量。为了校正尿液中BPA和TCS浓度,分析采用Cr校正的BPA/TCS值(1*10^-4mg/g Cr)。3、分析尿液中BPA和TCS浓度分组与人口学资料（如:年龄、BMI）和基础生殖指标相关性,采用Kruskal-Wallis检验分析连续型变量,采用卡方（chi-squared）检验分析计数型资料。分别对尿液BPA和TCS浓度分组间,采用均值±标准差/均值（95%置信区间）和频数（百分比）对各指标进行描述性统计。4、将尿液中BPA和TCS浓度从低到高排序,按照四分位法分成四个有序等级,将Q1作为对照组,其余组（Q2、Q3和Q4）分别与Q1进行比较,采用多变量广义线性混合模型（Multivariable generalized linear mixed model）分别分析BPA和TCS对于促排卵结局的相关性（Gn用量、内膜厚度、优势卵泡数、E₂peak、获卵数、受精率、卵裂率和优胚率）。5、采用广义线性混合模型分别分析新鲜周期移植和首次冷冻周期移植的临床结局（生化妊娠、临床妊娠、着床率、流产率和活婴出生率）与BPA和TCS的相关性,协变量为年龄,BMI,基础FSH,基础E₂和AFC。6、对于BPA和TCS的复合暴露与IVF结局的相关性使用带有交互项的广义线性混合模型进行分析。结果:1、BPA的检出率为83.4%（293/351）,浓度范围为:检测限（limit of detection,LOD）至12.86 ng/ml（49.282 ug/g Cr）,中位数（Q1-Q3）为0.720（0.246-2.021）ug/g Cr,最大值为12.862ng/ml,49.282*10^-3mg/g Cr。2、统计显示:尿液中BPA浓度最高组（Q4）中的卵母细胞总数显著低于对照组（Q1）,且差异具有统计学意义。3、在协变量（年龄、体重指数、基础FSH、基础E₂和AFC）校正和未校正的分析模型中,E₂peak、内膜厚度、优势卵泡数、Gn用量、受精率、卵裂率和优胚率在BPA高浓度组和对照组之间差异均无统计学意义。4、新鲜周期中:在协变量（年龄、体重指数、基础FSH、基础E₂和AFC）校正和未校正的分析模型中,在BPA最高浓度组（Q4）种植率显著低于对照组（Q1）,且差异具有统计学意义（p<0.05）,同时临床妊娠率和种植率的总体趋势p<0.05。然而无论是在有无协变量校正下,生化妊娠、流产和活婴出生率在BPA高浓度组和对照组之间差异均没有统计学意义。5、冷冻周期中:无论是在有无协变量校正下,生化妊娠、临床妊娠、种植和活婴出生率在BPA高浓度组和对照组之间差异均没有统计学意义。6、TCS的检出率为94.7%（286/302）,浓度范围为:检测限（limit of detection,LOD）至34.95ng/ml（49.282 ug/g Cr）,中位数（Q1-Q3）为0.894（0.316-3.048）μg/g Cr。7、在协变量校正（年龄、体重指数、基础FSH、基础E₂和AFC）及未校正的分析模型中,E₂peak、内膜厚度、优势卵泡数、Gn用量、获卵数、受精率、卵裂率和优胚率在TCS高浓度组和对照组之间差异均没有统计学意义。8、在新鲜周期和冷冻周期中:在校正（年龄、体重指数、基线FSH、基线E₂和AFC）及未校正的模型中,无论是有无协变量校正下,生化妊娠、临床妊娠、种植、流产和活婴出生率在TCS高浓度组和对照组之间差异均没有统计学意义。9、尿液中BPA与TCS复合暴露,与IVF病人的促排卵结局和临床结局没有相关性。结论:1、BPA暴露可以影响IVF病人卵子的获取、胚胎种植和妊娠的发生。2、TCS暴露对IVF病人的促排卵结局和临床结局无明确影响效应。3、BPA和TCS复合暴露在促排卵和临床结局中均未发现具有协同或拮抗作用。第二部分探索BPA对人颗粒细胞GJA1表达的影响及相关分子机制研究研究目的:分析人颗粒细胞和KGN细胞缝隙连接蛋白基因和甾体激素合成关键酶相关基因表达的改变,探索BPA诱导的相关基因改变的调控机制。材料和方法:1、收集IVF病人取卵日的卵泡穿刺液,使用淋巴细胞分离液分离收获颗粒细胞,用含10%FBS的DMEM-F12培养基培养48h后,进行换液,BPA10ug/ml培养基和0.05%DMSO的培养基继续培养48h,收集细胞,提取总RNA,先行m RNAmicroarray检测（三个独立样本的生物学重复）,并对测序结果进行生物信息学分析,包括KEGG和GO聚类分析,挑选差异基因GJA1。应用RT-PCR和Western blot验证GJA1基因分别在经5种不同浓度的BPA（0.001ug/ml、0.01ug/ml、0.1ug/ml、1ug/ml和10ug/ml）暴露48h的人颗粒细胞和KGN细胞中的表达情况;2、使用流式细胞分析仪和Western-blot分别检测人颗粒细胞在分离培养48h,经BPA（10ug/ml）处理48h后其细胞凋亡百分比和凋亡相关基因蛋白表达水平。3、通过细胞免疫荧光和免疫组化分别在BPA处理后的人颗粒细胞和染毒小鼠的卵巢中检测GJA1蛋白表达水平。4、通过使用小干扰siRNA在KGN细胞中低表达基因GJA1,观察激素合成关键酶P450Scc、Star和3β-HSD表达的变化。5、通过荧光定量RT-PCR和Western-blot方法分别对P450Scc、Star和3β-HSD观察在5种不同浓度的BPA（0.001ug/ml、0.01ug/ml、0.1ug/ml、1ug/ml和10ug/ml）暴露48h后的人颗粒细胞和KGN细胞中的表达情况。6、通过焦磷酸测序的方法评估KGN细胞在BPA处理后基因GJA1启动子区的甲基化修饰水平的改变。7、KGN细胞常规培养,通过荧光定量PCR观察BPA10ug/ml处理组和对照组中miRNAs的表达,通过过表达miR-206,探索miR-206在KGN细胞中的功能性作用。8、在工具细胞293T中,使用双荧光素酶报告基因实验,验证miR-206与基因GJA1的结合靶点。结果:1、人颗粒细胞凋亡百分数在BPA暴露组和对照组之间差异没有统计学意义。蛋白水平:caspase3、bcl-2和bax的表达在BPA暴露组和对照组之间差异无统计学意义。2、在人颗粒细胞中m RNA水平和蛋白水平确认了GJA1基因分别在人颗粒细胞和KGN细胞的BPA暴露组中表达降低;3、人颗粒细胞免疫荧光实验和染毒小鼠卵巢免疫组化实验结果提示在BPA暴露情况下,GJA1蛋白表达均显著下降,差异具有统计学意义。4、人颗粒细胞和KGN细胞培养上清中孕激素随着BPA暴露浓度梯度的升高,其表达水平呈梯度下降,在BPA暴露较高浓度组差异具有统计学意义。5、在KGN细胞中,小干扰siRNA下调GJA1基因的表达后P450Scc和Star表达在m RNA水平和蛋白水平均显著下调,且差异具有统计学意义。6、BPA暴露后GJA1启动子区平均甲基化水平与对照组之间没有差异,然而在各个位点的甲基化水平的比较中发现,第4个Cp G岛的甲基化水平显著高于对照组,差异具有统计学意义。7、miR-206过表达可以使KGN细胞中GJA1基因在m RNA水平和蛋白水平表达降低,差异具有统计学意义。8、miR-206显著的降低了野生型293T细胞的相对荧光素酶活性,但是对突变型的293T细胞没有明显的影响。结论:1、BPA暴露与颗粒细胞凋亡无明显剂量-效应相关性。2、BPA暴露可以影响GJA1的表达,同时导致颗粒细胞合成孕激素能力下降,GJA1可能参与卵巢颗粒细胞激素合成关键酶的表达调控。3、启动子区的甲基化可能参与调控BPA诱导的GJA1的表达调控。4、miR-206通过靶向抑制BPA诱导的GJA1的异常表达,从而影响缝隙连接。