目的：恶性肿瘤严重威胁着人类的健康，食管癌(esophageal cancer, EC)是常见的恶性肿瘤之一，华北处于全球食管癌的高发区，尤其是河北省的磁县和涉县。食管癌主要包括两种组织学类型：食管鳞癌(esophagealsquamous cell carcinoma, ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)。食管癌起病隐匿，症状明显时多数已是肿瘤的中晚期，预后较差。要降低食管癌的发病率和死亡率，必须重视其发病机制的研究以做到早期诊断。除DNA核苷酸序列改变可影响肿瘤发生发展外，表观遗传学机制在肿瘤形成过程中的作用越来越受到重视。DNA甲基化是真核细胞基因组研究最多也是最普遍的表观遗传学改变，异常的DNA甲基化在肿瘤患者的肿瘤组织和血液中均可检测到，预示着它有可能作为一种新的肿瘤形成敏感指标，应用于肿瘤的预防和治疗。RASSF1是2000年Dammann R等在非小细胞肺癌的研究中通过酵母双杂合筛选发现的肿瘤抑制基因，通过促凋亡、抑制细胞增长和迁移等功能发挥抑制肿瘤的作用。RASSF1基因共有七个转录本RASSF1A-G,其中RASSF1D-G与RASSF1A的基因定位相同，第一外显子均为外显子1α，启动子区所含CpG岛相同。RASSF1A-C在染色体上的基因定位不同，所对应的启动子区亦不同，而且作为RASSF1基因的主要转录本，RASSF1A、RASSF1B和RASSF1C在组织中的分布有可能不同。RASSF1A启动子区DNA异常高甲基化可能是导致该基因在多种肿瘤中低表达的重要机制之一，而有关RASSF1不同转录本在食管鳞癌中的表达及其表观遗传学失活机制的研究未见报道。本研究通过检测RASSF1的主要转录本RASSF1A、RASSF1B和RASSF1C在食管鳞癌中的表达，确定与食管鳞癌发生发展密切相关的主要转录本，并探讨其表观遗传学失活机制，以期为食管癌的防治提供有价值的分子靶点。方法：1应用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chainreaction, RT-PCR)技术检测48例食管鳞癌组织及相应癌旁正常组织中RASSF1基因主要转录本RASSF1A、RASSF1B和RASSF1C的mRNA表达情况。2应用免疫组织化学(immunohistochemistry)SP法检测48例食管鳞癌组织及相应癌旁正常组织中RASSF1A蛋白的表达情况。3应用甲基化特异性PCR(methylation specific polymerase chainreaction, MSP)技术检测48例食管鳞癌组织及相应癌旁正常组织中RASSF1A基因的甲基化状态。4运用统计软件SPSS13.0对数据进行统计学分析。结果：1食管鳞癌组织中RASSF1基因主要转录本RASSF1A、RASSF1B和RASSF1C的mRNA表达1.1食管鳞癌组织中RASSF1A的mRNA表达RASSF1A在食管鳞癌和相应癌旁正常组织中的mRNA相对表达量分别为0.31±0.28和1.1±0.65，RASSF1A在癌组织中的mRNA表达水平明显低于癌旁正常组织(P=0.000)。进一步分组分析发现，RASSF1A的mRNA表达与患者的年龄(P=0.462)、性别(P=0.277)无相关性，而与淋巴结转移、肿瘤组织的TNM分期和分化程度密切相关：RASSF1A在无淋巴结转移组的mRNA相对表达量为0.53±0.26，显著高于有淋巴结转移组的相对表达量0.08±0.05(P=0.000)；RASSF1A在Ⅰ+Ⅱ期组的mRNA相对表达量为0.36±0.29，显著高于Ⅲ+Ⅳ期组的相对表达0.16±0.18(P=0.007)；RASSF1A在高中分化组的mRNA相对表达量为0.44±0.30，显著高于低分化组的相对表达量0.14±0.15(P=0.005)。1.2食管鳞癌组织中RASSF1B的mRNA表达RASSF1B在食管鳞癌和相应癌旁正常组织中的mRNA相对表达量分别为0.60±0.28和0.67±0.52，两者的差异无统计学意义(P=0.742)。1.3食管鳞癌组织中RASSF1C的mRNA表达RASSF1C在食管鳞癌和相应癌旁正常组织中的mRNA相对表达量分别为0.84±0.42和0.97±0.39，两者的差异无统计学意义(P=0.332)。2食管鳞癌组织中RASSF1A蛋白表达48例食管鳞癌组织中，其中11例RASSF1A基因蛋白表达阳性，阳性表达率为22.9%；正常食管黏膜组织48例，其中40例RASSF1A基因蛋白表达阳性，阳性表达率为83.3%，正常食管黏膜组织RASSF1A蛋白阳性表达率显著高于食管鳞癌组织(P=0.000)。进一步分组分析发现,RASSF1A蛋白表达与患者年龄(P=1.000)、性别(P=1.000)、肿瘤组织TNM分期(P=0.552)无相关性，而与淋巴结转移和肿瘤组织分化程度密切相关：RASSF1A蛋白在无淋巴结转移组的阳性表达率为36.4%(8/22)，显著高于有淋巴结转移组的阳性表达率11.5%(3/26)(P=0.041)；RASSF1A蛋白在高中分化组的阳性表达率为40.9%(9/22)，显著高于低分化组的阳性表达率7.7%(2/26)(P=0.006)。3食管鳞癌组织中RASSF1A基因甲基化状态RASSF1A基因启动子区附近含有两个CpG岛，根据CpG位点的分布分别选择了三个不同区域进行RASSF1A甲基化状态的研究，将转录起始点设为+1，位点一位于-159至-36处，位点二位于+103至+302处，位点三位于+337至+494处。3.1位点一的甲基化状态RASSF1A基因该位点在食管鳞癌组织和相应癌旁正常组织中的甲基化率分别为35.4%(17/48)和14.6%(7/48)，食管鳞癌组织中RASSF1A基因该位点甲基化率显著高于癌旁正常组织(P=0.021)。进一步分组分析发现,RASSF1A基因该位点甲基化率与患者年龄(P=0.732)和性别(P=0.654)、肿瘤组织TNM分期(P=0.117)无相关性；而与淋巴结转移和肿瘤组织分化程度密切相关：RASSF1A基因该位点在有淋巴结转移组的甲基化发生率为57.7%(15/26)，显著高于无淋巴结转移组的甲基化发生率9.1%(2/22)(P=0.000)； RASSF1A基因该位点在低分化组的甲基化发生率为50%(13/26)，显著高于高中分化组的甲基化发生率18.2%(4/22)(P=0.022)。3.2位点二的甲基化状态RASSF1A基因该位点在食管鳞癌组织和癌旁正常组织中的甲基化率分别为41.7%(20/48)和18.8%(9/48)，食管鳞癌组织中RASSF1A基因该位点甲基化率显著高于癌旁正常组织(P=0.019)。进一步分组分析发现，RASSF1A基因该位点甲基化率与患者年龄(P=0.883)和性别(P=0.875)无相关性；而与淋巴结转移、肿瘤组织的TNM分期和分化程度密切相关：RASSF1A基因该位点在有淋巴结转移组的甲基化发生率为57.7%(15/26)，显著高于无淋巴结转移组的甲基化发生率22.7%(5/22)(P=0.014)；RASSF1A基因该位点在Ⅲ+Ⅳ期组的甲基化发生率为66.7%(8/12)，显著高于Ⅰ+Ⅱ期组的甲基化发生率33.3%(12/36)(P=0.043)；RASSF1A基因该位点在低分化组的RASSF1A甲基化发生率为57.7%(15/26)，显著高于高中分化组的甲基化发生率22.7%(5/22)(P=0.014)。3.3位点三的甲基化状态RASSF1A基因该位点在食管鳞癌组织和癌旁正常组织中的甲基化率分别为50%(24/48)和18.8%(9/48)，食管鳞癌组织中RASSF1A基因该位点甲基化率显著高于癌旁正常组织(P=0.003)。进一步分组分析发现，RASSF1A基因该位点甲基化率与患者年龄(P=0.771)和性别(P=0.755)无相关性；而与淋巴结转移、肿瘤组织的TNM分期和分化程度密切相关：RASSF1A基因该位点在有淋巴结转移组的甲基化发生率为69.2%(18/26)，显著高于无淋巴结转移组的甲基化发生率27.3%(6/22)(P=0.004)；RASSF1A基因该位点在Ⅲ+Ⅳ期组的甲基化发生率为83.3%(10/12)，显著高于Ⅰ+Ⅱ期组的甲基化发生率38.9%(14/36)(P=0.008)；RASSF1A基因该位点在低分化组的甲基化发生率为73.1%(19/26)，显著高于高中分化组的甲基化发生率22.7%(5/22)(P=0.001)。4RASSF1A基因mRNA和蛋白表达及其甲基化之间的相关性4.1RASSF1A基因mRNA和蛋白表达之间的相关性RASSF1A蛋白表达阳性的食管鳞癌组织中mRNA相对表达量为0.49±0.29，RASSF1A蛋白表达阴性的食管鳞癌组织mRNA相对表达量为0.04±0.03，两者差异有统计学意义(P=0.010)。4.2RASSF1A基因甲基化与mRNA、蛋白表达之间的相关性4.2.1位点一：RASSF1A基因该位点甲基化阳性的食管鳞癌组织mRNA相对表达量为0.16±0.16，甲基化阴性的食管鳞癌组织中mRNA相对表达量为0.47±0.32，两者差异有统计学意义(P=0.019)。RASSF1A基因该位点甲基化阳性的食管鳞癌组织中RASSF1A蛋白表达阳性率为23.5%(4/17)，甲基化阴性的食管鳞癌组织中RASSF1A蛋白表达阳性率为22.6%(7/31)，两者差异无统计学意义(P=1.000)。4.2.2位点二：RASSF1A基因该位点甲基化阳性的食管鳞癌组织mRNA相对表达量为0.18±0.18，甲基化阴性的食管鳞癌组织中mRNA相对表达量为0.44±0.33，两者差异有统计学意义(P=0.007)。RASSF1A基因该位点甲基化阳性的食管鳞癌组织中RASSF1A蛋白表达阳性率为10%(2/20)，甲基化阴性的食管鳞癌组织中RASSF1A蛋白表达阳性率为32.1%(9/28)，两者差异无统计学意义(P=0.147)。4.2.3位点三：RASSF1A基因该位点甲基化阳性的食管鳞癌组织mRNA相对表达量为0.18±0.17，甲基化阴性的食管鳞癌组织中mRNA相对表达量为0.44±0.32，两者差异有统计学意义(P=0.006)。RASSF1A基因该位点甲基化阳性的食管鳞癌组织中RASSF1A蛋白表达阳性率为8.3%(2/24)，甲基化阴性的食管鳞癌组织中RASSF1A蛋白表达阳性率为37.5%(9/24)，两者差异有统计学意义(P=0.016)。结论：1RASSF1基因RASSF1A转录本在食管鳞癌中表达较之相应癌旁正常组织降低，而转录本RASSF1B和RASSF1C在食管鳞癌及其癌旁正常组织中表达无明显差异。2RASSF1A的表达降低可能与食管鳞癌发生有关，且RASSF1A基因启动子区及第一外显子区DNA高甲基化可能是食管鳞癌中RASSF1A蛋白低表达的机制之一。3RASSF1A基因启动子区及第一外显子区不同CpG位点的甲基化率不同，提示RASSF1A关键性CpG位点的甲基化有可能是导致其在食管鳞癌中表达降低的主要机制之一。4RASSF1A甲基化状态与患者年龄、性别等因素无关，与淋巴结转移、分化程度和临床分期等有关，提示RASSF1A甲基化可能与食管鳞癌的发生发展和预后相关。