烟草翻译起始因子家族成员eIF4E-6(Ntab0942120)与马铃薯Y病毒VPg互作决定着PVY对烟草的侵染进程,为打断PVY对烟草细胞的侵染途径,增强烟株自身对PVY的抗性,本研究应用TALENs技术,对烟草eIF4E-6基因进行了靶向修饰。1.eIF4E-6基因TALENs表达载体的构建综合eIF4E-6与烟草eIF4E家族成员序列比对和TALEN Targeter在线软件设计TALENs靶序列,进行TALEN模块组装构建TALENs表达载体,利用Luciferase–SSA报告载体法进行TALENs活性评价,获得体外DNA剪切活性较为理想的两个TALENs表达载体T3和T4,构建TALEN敲除载体并用电击法导入LBA4404感受态细胞制备工程菌。2.转化烟草采用根癌农杆菌介导的叶盘法,转化易感PVY的烟草品种K326,并对转化苗进行潮霉素B抗性基因的PCR检测,分别获得了T3和T4 TALENs表达载体的T0代阳性转化烟株40和50株。3.eIF4E-6基因突变位点的检测阳性转化子DNA进行eIF4E-6基因的PCR扩增,扩增产物连入T载体克隆测序,经序列比对,T0代群体中,表达载体T3获得靶位点大片段碱基缺失突变型1株、靶位点碱基替换突变型3株。表达载体T4获得靶位点碱基替换突变型5株。4.突变材料的抗性分析接种PVY后突变材料症状较野生对照有所减轻,Real Time RT-PCR检测结果表明突变株的eIF4E-6基因表达量与病毒量均低于非转基因K326烟株。5.突变材料的生理生化分析接种PVY后,烟株体内酶活性检测结果发现各突变型T0代烟株的PAL、POD和SOD活性与野生型K326烟株相比有不同程度的升高。