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[目的]阴沟肠杆菌是一种机会致病菌,是肠道正常菌群中的一种,可引起多种肠道外感染。耐药基因blaNDM-1可编码新德里金属β内酰胺酶1,它是阴沟肠杆菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的主要机制之一。本研究的目的是阐明耐药基因blaNDM-1对阴沟肠杆菌生物学特性和致病性的影响,为携带blaNDM-1的碳青霉烯类耐药阴沟肠杆菌的预防控制和临床诊疗提供依据。[方法]1.质粒稳定性实验:将前期研究筛选得到的携带耐药基因blaNDM-1的阴沟肠杆菌T2（NDM-1组）、阴沟肠杆菌T2 blaNDM-1基因敲除株（△NDM-1组）及阴沟肠杆菌ATCC13047（ST组）传代200次后,首先进行抗菌药物敏感实验,接着检测是否携带blaNDM-1基因,据此判断传代中携带blaNDM-1基因的质粒是否会出现丢失。2.耐药基因blaNDM-1对阴沟肠杆菌生物学特性和致病性研究:首先研究前期研究筛选得到的携带耐药基因blaNDM-1的阴沟肠杆菌T2、阴沟肠杆菌T2 blaNDM-1基因敲除株及阴沟肠杆菌ATCC13047来探讨耐药基因blaNDM-1对它们生物学特性的影响,接着在细胞和动物水平研究耐药基因blaNDM-1对阴沟肠杆菌致病性的影响。2.1阴沟肠杆菌的生物学特性研究:包括耐药和毒力基因的扩增、运动性实验、生物膜形成能力和血清抗性实验。实验组包括携带耐药基因blaNDM-1的阴沟肠杆菌T2、阴沟肠杆菌T2 blaNDM-1基因敲除株及阴沟肠杆菌ATCC13047,PCR扩增三株阴沟肠杆菌携带的常见的碳青霉烯类耐药基因和毒力基因,并测序验证。2.2细胞实验:黏附侵袭实验、LDH浓度的测定。2.3动物实验:在一周内腹膜炎ICR小鼠的死亡数量,腹膜炎小鼠肝脏、肺脏和小肠组织的病理特征,脾脏带菌量,肝脏、肺脏和脾脏产生的细胞因子IL-1β、IL-6 及 TNF-α的含量。3.统计学分析:采用IBM SPSS 20.0统计学软件包进行数据分析。[结果]1.质粒稳定性实验:传代200次后,阴沟肠杆菌T2仍携带blaNDM-1基因,阴沟肠杆菌T2 blaNDM-1基因敲除株不携带blaNDM-1基因,阴沟肠杆菌ATCC13047不携带blaNDM-1基因,表明携带blaNDM-1基因的质粒未丢失,稳定存在。2.耐药基因blaNDM-1对阴沟肠杆菌生物学特性和致病性影响的研究结果2.1阴沟肠杆菌的生物学特性研究:①耐药基因和毒力基因的检测:携带耐药基因blaNDM-1的阴沟肠杆菌T2仅携带碳青霉烯类耐药基因blaNDM-1,其他碳青霉烯类耐药基因blaKPC-2、blaIMP-4、blaVIM-1、blaOXA-48均为阴性,阴沟肠杆菌T2 blaNDM-1基因敲除株和阴沟肠杆菌ATCC13047所检测的五种碳青霉烯类耐药基因均为阴性;阴沟肠杆菌T2与阴沟肠杆菌T2 blaNDM-1基因敲除株有相同的毒力基因clpB、icmf、acrA,其他毒力基因VasD/Lip、wcam、fimH、mrkD、mrkB及csgB均为阴性,阴沟肠杆菌ATCC13047中毒力基因clpB、icmf、acrA、VasD/Lip和wcam为阳性,未检测出fimH、mrkD、mrkB及csgB。②携带耐药基因blaNDM-1的阴沟肠杆菌T2的运动直径为0.785±0.127cm,阴沟肠杆菌T2 blaNDM-1耐药基因敲除株的运动直径为1.445±0.255cm,阴沟肠杆菌ATCC13047的运动直径为1.370±0.270cm,阴沟肠杆菌T2 blaNDM-1耐药基因敲除株与阴沟肠杆菌ATCC13047的运动直径高于携带blaNDM-1耐药基因的阴沟肠杆菌T2,差异具有统计学意义。③在三个时间点24h、48h、72h,携带blaNDM-1耐药基因的阴沟肠杆菌T2与阴沟肠杆菌T2 blaNDM-1耐药基因敲除株的生物膜吸光度值无统计学差异,它们均高于阴性对照组的吸光度值,但比阴沟肠杆菌ATCC13047的吸光度值低。④血清抗性实验结果显示,携带耐药基因blaNDM-1的阴沟肠杆菌T2的存活率为0.624±0.112,阴沟肠杆菌T2 blaNDM-1耐药基因敲除株的存活率为0.476±0.143,阴沟肠杆菌ATCC13047的存活率为0.533±0.166,三组未见统计学差异。2.2细胞实验:①阴沟肠杆菌与RAW264.7共同孵育3h后结果显示,黏附实验结果显示阴沟肠杆菌T2 blaNDM-1耐药基因敲除株与阴沟肠杆菌ATCC13047存在统计学差异（P=0.019）,其他各组间均无统计学差异,侵袭实验显示三组均未见统计学差异;共同孵育24h后,黏附实验与侵袭实验均显示阴沟肠杆菌T2 blaNDM-1耐药基因敲除株与阴沟肠杆菌ATCC13047存在统计学差异,携带blaNDM-1耐药基因的阴沟肠杆菌T2与阴沟肠杆菌ATCC13047存在统计学差异,携带blaNDM-1耐药基因的阴沟肠杆菌T2与阴沟肠杆菌T2 blaNDM-1耐药基因敲除株未见统计学差异。②LDH浓度测定显示三组细胞上清液中的LDH浓度未见统计学差异。2.3动物实验:①当给实验组腹腔注射7.5×108cfu、0.4ml的菌液后,阴性对照组注射0.4ml LB液体培养基,在一周内阴性对照小鼠无明显变化,在三个实验组中,生存曲线无统计学差异,感染阴沟肠杆菌ATCC13047的小鼠死亡数最少,感染携带耐药基因blaNDM-1的阴沟肠杆菌T2的小鼠的死亡数最多。②与阴性对照组相比,在感染阴沟肠杆菌24h后,三个实验组小鼠的肝脏、肺脏和小肠组织均有不同程度的炎症病理改变,但病理评级并无统计学差异。③在小鼠感染24h、48h、72h后,阴沟肠杆菌ATCC13047组的小鼠脾脏载菌量比携带耐药基因blaNDM-1的阴沟肠杆菌T2和阴沟肠杆菌T2 blaNDM-1耐药基因敲除株组的小鼠的脾脏载菌量低（P<0.05）,但携带耐药基因blaNDM-1的阴沟肠杆菌T2和阴沟肠杆菌T2 blaNDM-1耐药基因敲除株感染小鼠的脾脏带菌量没有统计学差异。④在肝脏、肺脏、脾脏检测到的IL-1β、IL-6、TNF-α含量在携带blaNDM-1耐药基因的阴沟肠杆菌T2组和阴沟肠杆菌T2 blaNDM-1耐药基因敲除株组未见统计学差异。[结论]1.耐药基因blaNDM-1可减弱阴沟肠杆菌的运动能力,但不影响阴沟肠杆菌的生物膜形成和血清抗性能力。2.携带耐药基因blaNDM-1的阴沟肠杆菌感染小鼠后,它的死亡率稍高于其他组,但耐药基因blaNDM-1并不增加阴沟肠杆菌的毒力,同时它也不影响腹膜炎小鼠内脏器官分泌的细胞因子IL-1 β、IL-6和TNF-α的含量。