论文部分内容阅读
矮牵牛(Petunia hybrida)属于茄科(Solanaceae)碧冬茄属(petunia)植物,花色品种丰富、花期长、是重要的花坛和盆栽花卉,在园林中应用极其广泛。矮牵牛生活周期短,栽培容易,基因组已测序成功,遗传背景清晰,农杆菌易转化等优点不但是转基因的理想模式植物,而且是观赏植物研究的模式植物。园林中许多植物栽培中往往需要多次人工打顶增加植物分枝数目以达到花朵繁茂的观赏效果,大大提高了生产成本,成为制约产业发展的瓶颈问题。培育多分枝的矮牵牛新品种不但是解决植物高效生产的关键,而且还是开展分枝发育研究的重要材料,为其它植物多分枝研究提供借鉴。对拟南芥的研究发现WRKY71通过上调分枝发育基因引起拟南芥分枝增多,通过提高对生长素的运输能力对分枝发育起作用。AtWRKY71过表达后引起了拟南芥分枝数目的增多,而进化树显示WRKY28与WRKY71亲缘关系较近。由此,我们推测WRKY28在调控植物分枝中也起着重要作用。本实验通过对PhWRKY28与PhWRKY71基因克隆与生物信息学分析,对矮牵牛不同组织以及NaCl和PEG干旱处理后转录水平的表达进行分析,克隆PhWRKY28与PhWRKY71的启动子序列并进行信息学分析,主要研究结果如下:(1)根据已经公布的矮牵牛基因组序列设计特异性引物,以矮牵牛(P.hybrida)cDNA为模板,克隆获得PhWRKY28和PhWRKY71 cDNA序列,并对其进行生物信息学分析。其中PhWRKY28 CDS区全长为924 bp,编码307个氨基酸,与烟草、辣椒的相似性分别是82%、65.4%,该蛋白的分子式为C2875H4828N92401186S189,其中丙氨酸Ala(A)最多,为316个,占总蛋白的34.2%;PhWRKY71 CDS区全长为1005 bp,编码有334个氨基酸,与烟草、辣椒相似性分别为69%,67%。该蛋白分子式为C1633H2503N465O524S14,其中所含丝氨酸Ser最多为47个,占总蛋白的14.1%。(2)通过实时荧光定量表达分析表明矮牵牛PhWRKY28和PhWRKY71基因在矮牵牛根、茎、叶、叶腋和顶端中不同组织中均有表达,但表达水平存在差异,PhRKY28基因在茎中的表达量最高,顶端中最低,其中茎中的表达量约为为顶端中的1.72倍;而PhWRKY71在叶腋中的表达明显高于其他组织中的表达,顶端中的表达水平最低,叶腋中的表达量是顶端中表达量的2.5倍之多。(3)通过实时荧光定量表达分析PhWRKY28与PhWRKY71在NaCl和PEG处理后的表达特性,结果表明,PhWRKY28在NaCl处理12 h后表达量有所上调,PhWRKY71在NaCl处理12h后表达上调了 1.6倍,24 h后表达有所下降;用PhWRKY28和Ph WRKY71在PEG处理12 h后表达量都有所上调,24 h后的表达量较12 h后的表达均下调。(4)从矮牵牛中克隆出PhWRKY28和PhWRKY71的启动子序列,利用生物信息学软件预测分析,两个启动子序列上均有典型的真核生物基因启动子的核心元件TATA-box、CAAT box等。还有一些受逆境胁迫诱导的顺式调控元件,像ARE、MYB以及与植物激素相关的作用元件。Ph WRKY28有1个与植物组织分生组织表达有关的调控元件(CAT-box)。