研究背景胃癌是严重影响人们健康的重大疾病,揭示其发生发展的规律,寻找到其发生发展中的关键节点分子,进行早期防控和靶向性治疗,已经成为胃癌研究中的重要科学问题。幽门螺杆菌感染引起的胃粘膜上皮的慢性炎症跟胃癌的发生发展密切相关。慢性炎症经久不愈变为非可控性炎症,就为胃癌的发生奠定了基础,提供了有利于癌症发生的微环境。表观遗传学调控在癌症的发生发展中的作用越来越受到人们的重视。癌症的发生某种程度上可以说是异常基因表达累积的结果,因此表观遗传学调控的失调也会促进癌症的发生。而这种调控失调的累积也会促进癌症的恶性进展,即赋予了癌症局部侵袭和远处转移的能力。癌症的恶性进展,即侵袭和转移,是癌症生存率低预后差和容易复发的主要原因。在这个过程中,上皮间质化(EMT)扮演了重要角色。揭示癌症恶性进展的规律,发现在其中起关键作用的节点分子,开发更有效的靶向治疗药物,成为了癌症研究的热点。综上所述,在感染与炎症、胃癌的发生和胃癌的恶性进展中找到关键的调控方式使之联系起来是胃癌研究中的关键科学问题,表观遗传学调控给了我们很大的启示,经过我们的初步研究证明这种调控方式可以有效地联系胃粘膜慢性炎症和胃癌发生以及胃癌进展,从而让我们更清楚地了解肿瘤的发生发展规律,最终会为肿瘤的早期防控和靶向治疗提供有益借鉴。研究目的(一)探讨组蛋白去甲基化酶RBP2在幽门螺杆菌诱导的胃粘膜上皮细胞恶性转化中的作用及其分子机制,为胃癌的早期防控寻找有效靶标。(二)进一步揭示组蛋白去甲基化酶RBP2在胃癌的恶性进展中的作用及其分子机制,为胃癌的治疗提供理论参考。方法和结果(一)研究证实组蛋白去甲基化酶RBP2可以通过CagA-AKT-Sp1-RBP2-CyclinD1轴促进幽门螺杆菌诱导的胃粘膜上皮细胞的恶性转化1.幽门螺杆菌的毒力因子CagA可以诱导RBP2的表达：把CagA的表达质粒转入胃癌细胞后,RBP2被可以明显诱导表达。2. CagA诱导RBP2的表达是依赖于转录因子Sp1的：在胃癌细胞中,敲低Spl的表达后,CagA对于RBP2的诱导作用也会得到逆转。我们用EMSA和ChIP实验证明了Spl对RBP2启动子的直接结合作用。3. PI3K/AKT信号通路介导了Spl依赖性的CagA对RBP2的诱导表达：用AKT信号的特异性抑制剂LY294002处理胃癌细胞后,Spl的激活程度会降低,CagA对于RBP2的诱导作用就会得到逆转,同时也会逆转CagA对胃癌细胞增殖的促进作用。4. CagA诱导的RBP2可以靶向作用于Cyclin D1,从而促进胃癌细胞的不可控增殖：我们用PCR和western blot的方法证明了Cyclin D1是RBP2下游的一个靶分子。随着RBP2的表达下降,Cyclin D1的表达也降低。5.在慢性胃炎向胃癌演变过程中,RBP2和Spl表达呈正相关：我们在胃病变组织进行了RBP2和Spl的免疫组织化学染色,发现了RBP2和Spl的表达都随着疾病的进展而不断增高,且RBP2和Spl在病变组织中有共表达的现象。(二)进一步研究证实组蛋白去甲基化酶RBP2可以通过TGF-β1-p-Smad3-RBP2-E-cadherin-Smad3反馈环路促进胃癌的恶性进展1.RBP2在胃癌的恶性进展中发挥了重要作用,其对于胃癌细胞EMT发生是必要的：我们在胃癌细胞中敲低RBP2的表达后,发现细胞的侵袭转移能力都显著降低；同时胃癌细胞的干性样特征也显著下降。用稳定敲低RBP2的胃癌细胞尾静脉注射裸鼠后,和对照组相比,胃癌细胞转移到远处脏器的能力明显下降。相应地,我们在胃癌细胞中转入RBP2的高表达质粒后,细胞的侵袭转移能力显著增强。2.RBP2可以被TGF-β诱导表达,且对于TGF-β诱导的EMT发生是必需的：TGF-β可以以一种时间依赖性的方式来诱导RBP2的表达。TGF-β信号活化的磷酸化的Smad3可以结合到RBP2启动子上促进其转录表达。敲低RBP2的表达可以逆转TGF-β对细胞侵袭转移的促进作用,同时TGF-β对癌症细胞干性样特征的增强作用也被逆转。TGF-β对间质标志物的上调作用以及对上皮标志物的下调作用都会因为RBP2的敲低而得到部分逆转。3.RBP2通过直接抑制E-cadherin的表达来参与胃癌恶性进展的调控：敲低RBP2表达后,E-cadherin的表达明显被诱导。ChIP实验发现RBP2可以直接结合到E-cadherin的启动子上,抑制其表达。同时敲低RBP2和E-cadherin的表达,则RBP2敲低对胃癌细胞侵袭转移能力的抑制作用都会得到逆转；同时RBP2敲低对胃癌细胞干细胞样特征的抑制作用也会得到逆转,说明RBP2是通过调控E-cadherin的表达来参与胃癌恶性进展的。4.RBP2可以和p-Smad3相结合并被其招募到E-cadherin的启动子上增强对E-cadherin的抑制作用：免疫共沉淀实验证明RBP2和p-Smad3能够相互结合,且p-Smad3可能招募了RBP2到E-cadherin的启动子上,抑制其表达。5. E-cadherin可以通过抑制Smad3的磷酸化反馈调控RBP2的表达：E-cadherin在胃癌细胞中表达降低后,可以增强Smad3的磷酸化,从而促进了其对RBP2表达的促进作用,同时细胞的迁移能力也会加强。6.RBP2在进展期的胃癌组织中和Snail1共表达,且和E-cadherin表达呈负相关：我们选取了130例原发性进展性胃癌组织标本,进行了RBP2、 Snail1和E-cadherin的免疫组织化学染色,发现RBP2和Snail1的共表达。而且RBP2的表达和阳性对照Snail1一样,同E-cadherin的表达呈负相关关系。研究结论(一)RBP2可以通过CagA-AKT-Sp1-RBP2-Cyclin D1轴促进幽门螺杆菌诱导的胃粘膜上皮细胞的恶性转化,本部分研究揭示了胃炎向胃癌跨越过程中新的调控机制,即RBP2介导了感染向癌症的转化。因此RBP2可以作为胃癌早期防控的靶点分子。(二)RBP2可以通过TGF-β1-p-Smad3-RBP2-E-cadherin-Smad3反馈环路促进胃癌的恶性进展,本部分研究揭示了胃癌恶性进展中的表观遗传学调控新机制,丰富了我们对于癌症侵袭转移过程中生物学调控机制的认识。因此RBP2可以作为胃癌治疗的潜在靶点分子。