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兰花是开花植物中最大的家族之一，是整个兰科植物(orchidaceae)的总称，我国约有173属，1240余种。其中，大花蕙兰(Cymbidium hvbridium)，具有重要经济价值和观赏价值。兰科植物发育的一个独特特点是子房发育时间较长，且只有在授粉后才启动发育，形成的种子非常细小，发育不完全，几乎无胚乳，在自然状态下很难萌发，这使得兰花的有性繁殖困难、以至于整个兰科植物发育相关基础研究匮乏。本研究选取兰科植物中具有重要经济价值和观赏价值的大花蕙兰为研究材料，以大花蕙兰子房独特的发育模式为研究对象，从遗传学和表观遗传学不同角度，利用基因的差异显示技术、同源序列克隆技术及甲基化敏感限制内切酶扩增多态性分析技术等，探究大花蕙兰子房启动发育的分子机制，力图获得启动子房发育的关键基因及表观遗传调控模式，为揭示兰花子房发育的分子机制奠定基础。此外，还对兰科植物原球茎从形态学、细胞学及分子生物学方面进行了初步研究，旨在揭示兰花原球茎诱导、增殖、分化的内在机制。重点开展的研究如下：
1、应用mRNA差异显示技术比较、分析了大花蕙兰授粉后两天与未授粉子房的基因差异表达情况，共获得1024条带。其中60条带表现为在授粉后子房中特异表达，经进一步的反Northern杂交验证，最终确定在授粉后子房内特异表达的7个cDNA片段。测序后分别命名为CDD-313，CDD-272，CDD-265，CDD-243，CDD-193，CDD-218，CDD-470(GenBank登录号：DQ159862～DQ159868)。同源性比对发现，CDD-313，CDD-272，CDD-265和CDD-243没有同源序列与之匹配，可能代表了与大花蕙兰子房发育相关的新基因；而CDD-193，CDD-218和CDD-470的分析结果表明，三个序列分别与ABC型 transporter，GTPase和40S核糖体蛋白质S3(RPS3)高度同源。
2、通过对差异片段CDD-470进一步的深入分析，获得了CDD-470的全长cDNA序列，命名为Ch-RPS3(GenBank登录号：EF065683)，该序列全长1003bp，包含一个786 bp的完整开放读码框，可编码261个氨基酸。同源性比较和系统进化分析表明，Ch-RPS3在大花蕙兰中为首次报道，其编码的蛋白质与植物RpS3蛋白具高度相似性。进一步采用RT-PCR技术对不同大花蕙兰单株、根、茎、叶、花萼、花瓣、唇瓣及授粉前后子房等不同组织器官中Ch-RPS3的表达情况进行分析，结果证实Ch-RPS3的表达具有时空特异性，表现为在授粉后的子房内特异表达，推测它与大花蕙兰子房发育的启动密切相关。
3、根据MADS-box基因保守区结构，设计简并性引物，采用基于同源序列的基因克隆法结合3RACE技术，首次从大花蕙兰子房中分离和克隆到一个MADS-box基因全长cDNA序列-ChMADSl(GenBank登录号：DQ683575)，该序列全长871 bp，包含一个编码228个氨基酸的完整开放读码框，具有典型的植物MADS-box蛋白结构，由MADS盒、I、K、C区四部分组成。该基因编码的蛋白质与蝴蝶兰、石斛的AP3类MADS-box基因蛋白质。PeAP3(89％/94％)和DcOAP3A(89％/95％)高度同源，属于B组AP3基因家族中的paleoAP3基因。Southern分析结果表明大花蕙兰基因组中ChMADSl基因与其它植物的AP3类基因相似，是以低拷贝形式存在的。而RT-PCR和反Northern杂交分析证实ChMADSl在授粉后子房及花的萼片、花瓣、唇瓣、蕊柱中特异性高度表达，而在其根、茎、叶及未授粉子房中不表达。结果分析表明(7hMADSl基因是B组AP3基因家族中的一员，与大花蕙兰子房启动发育的调控密切相关。
4、甲基化是基因组DNA的一种主要表观遗传修饰方式，在植物体的生长发育中起着重要的调节作用。本研究应用MSAP(methylation sensitive amplifled polymorphism)技术分析了大花蕙兰授粉前后子房DNA甲基化状态的变化。结果显示DNA甲基化在大花蕙兰子房发育过程中发生频繁，从授粉前后子房的总扩增位点甲基化率(11.6％和9.6％)和全甲基化率(7.1％和6.1％)来看，授粉后都略低于未授粉子房，表明子房在授粉后的发育过程中在某些位点发生了去甲基化。除甲基化水平有变化外，大花蕙兰子房授粉前后间的甲基化模式也存在较大差异，分为两大类，14种类型；这些模式的改变主要通过重新甲基化和去甲基化而引起。进一步说明在大花蕙兰子房启动发育过程中，表观遗传修饰也是一种重要的调控方式。
5、原球茎是大花蕙兰的一种重要的再生方式。本研究根据正交试验设计法，筛选并优化了大花蕙兰原球茎增殖及分化培养基，初步建立了原球茎的再生体系。观察到三种原球茎的存在形式-具有无限增殖能力的原球茎、发生自分化的原球茎及受诱导后可进行分化的原球茎。采用ISSR及染色体分析技术证实不同类型的原球茎在增殖、分化过程中基因组结构并未发生明显的变化。进一步通过MSAP技术对三种原球茎基因组DNA甲基化状态进行分析，选用72对引物进行选择性扩增，共得到6668条带，其中甲基化多态性带有970条带，占总甲基化带数94.3％。数据分析表明，总扩增位点的甲基化水平分别为增殖原球茎26.7％、自分化原球茎24.1％和诱导分化原球茎24.6％，而全甲基化率依次分别为12.2％、11.1％和11.4％，这三种原球茎甲基化的水平明显高于授粉后子房。而且，比较分析三种不同状态原球茎DNA的甲基化模式，发现处于三种不同状态的原球茎可产生62种不同的DNA甲基化模式。分化原球茎相对于增殖原球茎发生了不同程度的去甲基化，但自分化原球茎和诱导分化原球茎DNA甲基化发生的水平未发生明显改变而多态性模式差异显著，暗示DNA甲基化水平和模式进行了重新调整，DNA甲基化修饰可能是有选择性、倾向性的在细胞分化方面起到非常重要的调控作用。