目的:酒精性心肌病（alcoholic cardiomyopathy,ACM）是指大量长期饮酒所致心肌损伤而引起的一系列病理生理学的改变,临床表现为以心室扩张、心肌收缩力下降为主要特点的心肌疾病。研究表明,酒精性心肌病是心源性猝死的重要诱因之一,也是发生心力衰竭的病因之一。随着生活水平的提高,酒精性心肌病的发病率越来越高,病死率逐年增加。因此探索有效的药物防治乙醇暴露下的心肌损伤并研究其可能的机制有着重要的临床意义。酒精性心肌病的发病机制较多且复杂,目前已经发现的机制有:凋亡、线粒体功能障碍、氧化应激、自噬、乙醇对心肌细胞的直接毒性作用、神经激素的过度激活、钙离子稳态失去平衡等。其中凋亡被认为是乙醇暴露下损伤心肌细胞的主要原因。大量研究显示减轻心肌细胞凋亡可以减轻心肌损伤。因此用实验研究来探索有效的药物来减轻心肌细胞凋亡成为可行且重要的突破点。恩格列净（empagliflozin,EMPA）是一种新型靶点的口服降糖药物。它主要是通过抑制钠-葡萄糖协同转运蛋白2（SGLT2）的转运,从而减少肾小球滤液中的葡萄糖重吸收入血,进而降低血糖。它除了具有减轻心衰、改善血脂等心血管保护作用之外,还具有抗凋亡、抗氧化应激等药理学作用。最近有文献报道恩格列净可以通过减轻内质网应激来减少细胞凋亡从而减轻糖尿病心肌损伤。但目前对于乙醇暴露下的心肌损伤恩格列净是否存在的保护作用及可能的机制尚无相关报道。本研究通过对原代心肌细胞和H9c2细胞进行试验,明确恩格列净是否对乙醇暴露下的心肌损伤具有保护作用。为探究其发挥作用的可能机制我们用H9c2细胞的分组模型进行mRNA-seq测序,同时应用MOE软件对恩格列净可能发挥作用的靶基因进行预测。经过分析发现:恩格列净可能与SIRT1相结合,SIRT1可能是药物的分子靶点之一。同时通过差异基因的富集分析显示,恩格列净可能通过PI3K-Akt这个经典的抗凋亡通路发挥心肌的保护作用。结合文献报道,SIRT1可以与PTEN相结合,它可以通过调节PTEN-Akt通路参与凋亡过程,因此我们猜测恩格列净可能通过SIRT1-PTEN-Akt通路发挥抗凋亡作用进而保护心肌细胞减轻损伤。研究方法:1.以原代心肌细胞及H9c2细胞为研究对象,依据试验需求将其分为正常对照组、乙醇组、恩格列净预处理组（恩格列净+乙醇组）和EX-527（SIRT1的抑制剂）预处理组（恩格列净+乙醇+EX-527组）。采用CCK-8检测各组心肌细胞的存活率,找到恩格列净及乙醇的最适干预浓度。2.检测乳酸脱氢酶（LDH）的水平来评估心肌细胞损伤程度。3.流式细胞术检测各组心肌细胞的凋亡程度。4.采用平台测序技术,对H9c2细胞的对照组、乙醇组和恩格列净预处理组进行mRNA-seq测序。5.应用MOE软件进行恩格列净与SIRT1的分子对接。6.实时荧光定量PCR检测H9c2细胞的SIRT1的mRNA表达水平。7.检测各组心肌细胞的JC-1水平来评估线粒体膜电位的变化。8.采用Western blot法检测心肌细胞SIRT1、PTEN、t-Akt、p-Akt、Cytochrome C、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白的表达。9.实验数据用x±s表示,通过SPSS 17.0软件进行统计分析,应用独立样本t检验和单因素方差分析进行比较,P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.乙醇对心肌细胞存活率的影响呈浓度依赖性,经分析结果显示原代心肌细胞和H9c2细胞,乙醇干预的最适浓度均为200mmol/L。不同浓度恩格列净（0,1,5,10,20,40 and 80μmol/L）处理原代心肌细胞和H9c2细胞24小时显示80μmol/L细胞存活率有所下降,提示恩格列净的安全浓度在40μmol/L之内。恩格列净预处理组细胞存活率较乙醇组升高,并呈浓度依赖的方式,说明恩格列净对于乙醇暴露下的心肌细胞损伤具有保护作用。恩格列净的保护作用从0.5μmol/L开始有统计学意义,2.5μmol/L与5μmol/L时比较生存率未见明显提高,故后续实验以2.5μmol/L来研究恩格列净的保护作用。进行回复实验时,给予EX-527预处理后,细胞存活率降低,逆转了恩格列净的保护性作用。2.用LDH检测心肌细胞的损伤程度。结果显示:乙醇组与对照组相比,乙醇组心肌损伤程度明显。恩格列净预处理组与乙醇组相比,LDH明显降低,说明恩格列净预处理可以减轻乙醇暴露下的心肌损伤。进行回复实验时,给予EX-527预处理后,LDH水平升高,心肌细胞损伤程度增加,逆转了恩格列净的保护性作用。3.用Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡率。结果显示:乙醇组凋亡率明显增加,而恩格列净预处理组与乙醇组相比细胞凋亡率明显降低。在给予EX-527预处理组处理心肌细胞后发现,恩格列净对于乙醇的保护作用明显减弱,心肌细胞凋亡率增加。4.分别对H9c2细胞的对照组、恩格列净预处理组、乙醇组三组进行mRNA-seq的测序,汇总差异表达的基因,结果显示SIRT1在三组间差异明显,对差异基因进行富集分析,结果发现凋亡通路、PI3K-Akt通路组间差异明显。5.MOE分子对接结果:发现恩格列净可能与SIRT1相互作用。恩格列净与SIRT1三维结构之间相互作用,对接得分为-6.745。恩格列净与SIRT1的gln294形成了arene-H相互作用。6.行Q-PCR结果提示:SIRT1在对照组、乙醇组和恩格列净预处理组的三组间存在差异。7.JC-1检测结果显示:乙醇组红色荧光与绿色荧光比值降低,线粒体膜电位降低,给予恩格列净预处理后红色荧光与绿色荧光比值较前增加,线粒体膜电位较前升高,在给予EX-527处理后,恩格列净的保护性作用被明显减弱,线粒体膜电位明显降低。8.Western blot分析:结果显示cleaved caspase-3的水平在乙醇组表达升高,在恩格列净预处理组表达降低,说明恩格列净具有保护性作用,且原代心肌细胞和H9c2细胞验证的结果相一致。比较组间的p-Akt、SIRT1及PTEN的表达水平,结果显示乙醇组较对照组p-Akt及SIRT1水平明显降低,PTEN的表达升高。恩格列净预处理组明显增加了心肌细胞p-Akt、SIRT1蛋白表达,减少PTEN的表达。在给予EX-527预处理心肌细胞进行回复实验时发现,EX-527预处理组较恩格列净预处理组,p-Akt、SIRT1蛋白表达较前降低,PTEN的表达较前升高,t-Akt在各组间始终没有变化。在比较组间Bax、Bcl-2的表达水平时发现,乙醇组Bcl-2蛋白减少,而Bax表达较对照组明显增加,乙醇组Bcl-2/Bax比值较对照组降低。恩格列净预处理组Bcl-2的表达水平升高,Bax的表达水平较乙醇组对比有所降低,Bcl-2/Bax比值恩格列净预处理后有所升高。提示恩格列净具有抗凋亡的保护作用。在给予EX-527预处理进行回复实验时发现,Bax表达升高,而Bcl-2表达降低,恩格列净的保护性作用被逆转了。在验证线粒体凋亡相关蛋白cleaved caspase-9和Cytochrome C的水平时发现,乙醇组较对照组相比cleaved caspase-9的水平升高,给予恩格列净预处理后蛋白水平降低,给予EX-527回复实验时,cleaved caspase-9的水平较前升高。在细胞质中Cytochrome C在乙醇组水平升高,给予恩格列净预处理后较前减低,在线粒体蛋白中Cytochrome C在乙醇组表达减少,恩格列净预处理后蛋白水平较前升高,提示恩格列净减轻了细胞色素C从线粒体向细胞质的渗出。给予EX-527进行回复实验发现恩格列净的保护性作用消失了。在最后进行表型回复时,验证了cleaved caspase-3的水平在各组间的变化,发现在给予EX-527预处理组后cleaved caspase-3的水平升高,提示EX-527逆转了恩格列净的抗凋亡作用。结论:恩格列净通过SIRT1-PTEN-Akt途径减轻心肌细胞的线粒体凋亡,从而减轻乙醇暴露下的心肌损伤。SIRT1-PTEN-Akt信号通路可能是恩格列净对心肌细胞保护途径的一种新的解释。