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1997年H5N1型禽流感病毒首次跨越种属障碍在香港造成了18例人的感染,其中6例死亡。新基因型的H5N1流感病毒仍然在亚洲尤其是东亚多国传播,人感染的病例也在不断出现。人群对H5N1型流感病毒保护性免疫力的普遍缺乏有可能引起新一轮的流感大爆发。流感病毒的流行为研究病毒-宿主的进化提供了条件。流感病毒蛋白的不断变异使病毒能逃避宿主的免疫识别。抗原漂移是流感病毒变异的主要手段,也是病毒进化的主要机制。流感病毒表面糖蛋白血凝素HA分子是病毒基因组中变异率最高的分子,是中和性抗体的主要靶标,其与宿主细胞表面受体唾液酸残基末端的结合是决定宿主特异性的主要因素。HA蛋白由HA1和HA2两个亚单位组成,其中,HA1的变异频率高于HA2。HA1亚单位处于正达尔文选择产生新的变异株。对H3亚型HA分子的研究表明,处于HA蛋白表位区域的氨基酸相对于非表位区域氨基酸而言,其密码子使用更具有多样性。有研究证实了H3亚型HA分子存在免疫优势性位点,一个或两个免疫优势性位点的替换就能引起抗原性的改变。血凝素HA蛋白抗原性表位作图是研究其抗原性变异的第一步。我们的研究表明,制备的15株H5 HA蛋白特异的单抗的表位都位于A/HongKong/482/97 H5N1流感病毒株HA蛋白的HA1亚单位(amino acids1-329)。其中,10株单抗(H5M2, 5, 9, 11, 12, 24-26 and 28-29)识别的是位于H5 HA蛋白1-302氨基酸区域的非重叠或部分重叠抗原性位点。但是,当我们对H5 HA蛋白1-302氨基酸区域进一步截短时,由于破坏了52位和277位的二硫键,造成了单抗的不识别。此外,我们还鉴定了位于H5 HA蛋白69-133氨基酸区域的一个线性表位,该表位被单抗H5M20特异性识别。与人源性H3亚型HA分子不同的是,H5亚型HA分子是禽源性的,二者面临不同的免疫选择压力。H5亚型HA分子与H3亚型HA分子在进化上有什么差异呢?我们从数据库http://www.biohealthbase.org中搜集了690个H5 HA的蛋白序列和核酸序列,对序列进行了比对,利用生物信息学及统计学方法分析了H5 HA分子的进化,并与H3 HA分子的进化作比较。我们发现:H5亚型HA分子与H3亚型HA分子在进化上存在显著差异。许多在H3亚型HA分子中处于多样性选择的残基在H5亚型HA分子中表现出没有或很低的密码子或氨基酸多样性。我们的研究还发现,一些不属于之前鉴定的131个HA分子抗原性位点的残基在H5 HA分子中展示出了多样化的选择。这些位点可能组成了新的H5N1流感病毒抗原性表位。同源性分析结果说明,2003年以后,H5N1流感病毒HA蛋白的HA1亚单位发生了高频率的突变。本研究对该区域的7个高突变氨基酸位点进行了变异分析,为单氨基酸替换对抗原抗体反应的影响提供了新的信息。研究表明,除了位点217之外的其它6个氨基酸替换都从不同程度上影响了HA13F与单抗的反应性。其中,124位的单氨基酸替换造成了所有4个单抗与HA13F的不识别。因此我们推论,位点124可能是H5亚型HA分子的免疫优势性位点,发生在该位点的变异能影响抗原抗体反应。那么,单氨基酸突变是否是通过改变抗原性表位的结构从而影响抗原抗体反应的呢?我们进一步利用计算机同源模建的方法验证这一假设。我们通过同源模建发现:位点124的替换能显著改变loop 152-159的空间结构,而loop 152-159相当于之前报道的H3亚型HA蛋白的抗原性区域B。该结果说明,氨基酸位点124虽然不属于H3亚型HA蛋白的抗原性位点,但在H5亚型HA蛋白中却提供了被单抗识别的结构基础,发生在该位点的替换能造成抗体结合位点的构象改变。本研究鉴定了H5亚型HA分子的构象性及线性表位,揭示了H5亚型HA分子与H3亚型HA分子在进化上的差异性。我们提出了单氨基酸替换造成表位空间构象的改变是HA分子抗原性变异的原因。本研究也发现了H5亚型HA分子新的免疫优势性位点。在今后的疫苗研究工作中,我们会进一步研究免疫优势性位点的改造对疫苗开发的潜力。