论文部分内容阅读
癫痫是一种常见的临床综合症。慢性、突发性和反复刻板性发作为其临床特征。复杂部分性发作导致患者海马选择性神经元死亡,海马硬化,导致记忆力下降,精神和认知障碍乃至痴呆,严重威胁着人类的身心健康。选择性神经元死亡对人类复杂部分性发作癫痫的形成起重要的作用。对癫痫发作诱导神经元死亡机制的研究,有助于我们寻找有效的神经元保护剂,提高癫痫治疗的疗效,减少致残率。动物实验研究发现,凋亡是颞叶癫痫或复杂部分性发作导致海马选择性神经元死亡的重要形式,癫痫发作激活了线粒体凋亡通路的 caspase-9 和casapse-3。最近研究发现,在凋亡通路中很多蛋白参与了对 caspase 的调控,发挥了促凋亡与抑凋亡作用,决定了细胞的命运。XIAP 是作用最强的凋亡抑制蛋白,直接结合并抑制激活的 caspase-9、casapse-3 和 casapse-7;Smac/DIABLO通过去除 XIAP 对 caspase 的抑制而促进 caspase 的激活;促凋亡蛋白 BAD 接受凋亡信号后与伴侣蛋白 14-3-3 分离而促进 caspase 的激活。关于 BAD 在癫痫发作致神经元凋亡的线粒体通路中的作用报道很少,而 XIAP 和 Smac/DIABLO 在此通路中的作用尚未见报道。为进一步阐明癫痫发作致神经元凋亡的线粒体通路机制以及寻找治疗癫痫发作致脑损伤的新靶点,我们用杏仁核注射 KA 诱导大鼠边缘叶发作模型,观察 XIAP、Smac/DIABLO、14-3-3 和 BAD 在发作前后表达的变化,并进一步证明了融合蛋白 PTD-XIAP(BIR3-RING)对癫痫发作致脑损伤的神经元保护,并探讨可能的作用机制。第一部分 杏仁核内注射 KA 诱导的边缘叶发作模型制作和致海马神经元凋亡的 分布 采用脑立体定位注射技术,以深部电极持续记录脑电和激光多普勒血流测定仪记录局部脑血流(regional cerebral blood flow, r-CBF),建立杏仁核注射红藻氨酸(kainic acid, KA)诱导的大鼠边缘叶发作模型,发作 1h 后静脉注射30mg/kg 安定终止发作,分别用 TUNEL 染色和 cresyl violet 染色观察海马神经元凋亡和存活的变化。结果显示,药物注射 15～20min 后动物均有癫痫发作。所有癫痫发作大鼠Ⅱ级脑电活动均较Ⅲ级和Ⅳ级脑电活动先出现,发作组Ⅳ级脑电活动(脑电图有高频高波伏丛集棘波)时程无明显差异。发作终止 8h 时,发作组选择性同侧海马 CA3 区出现 TUNEL 染色阳性细胞,24h 达高峰,72 h 下降。发 1<WP=6>复旦大学博士论文 摘要作前后 r-CBF 无明显变化。高频高波伏丛集棘波时程越长,CA3 区 TUNEL 染色阳性细胞越多。说明癫痫发作导致选择性海马 CA3 区神经元凋亡,可能与特异性脑电活动有关,但与脑缺血无关。第二部分 杏仁核内注射 KA 诱导的边缘叶发作致海马神经元凋亡的 线粒体通路机制 建立杏仁核注射 KA 诱导的大鼠边缘叶发作模型,检测 Smac/DIABLO、XIAP、BAD 和 14-3-3 蛋白在癫痫发作大鼠海马神经元的表达。单侧杏仁核内注射 KA 诱导癫痫发作,1h 后用安定终止发作,然后分别用 TUNEL 染色和 cresyl violet染色观察海马神经元存活和凋亡的变化,用免疫荧光和 western blot 检测海马Smac/DIABLO、XIAP、BAD、14-3-3、caspase-9 和 caspase-3 的表达。结果显示,发作终止 2h 时 KA 注射同侧海马 CA3 区细胞浆内 Smac/DIABLO 蛋白表达增加,4h时 caspase-9 和 caspase-3 出现裂解片段,8h 时出现 TUNEL 阳性细胞,24h 时达高峰。脑室内注射 caspase-9 抑制剂 z-LEHD-fmk 可减少 TUNEL 阳性细胞,增加存活神经元。发作后 KA 注射同侧海马 CA3 区神经元 caspase-9 和 caspase-3 免疫反应性增强,Smac/DIABLO 和 XIAP 弥散于整个神经元内,14-3-3 转移到神经元细胞核,BAD 与 14-3-3 共表达较对照减少;KA 注射对侧海马未检测到 TUNEL阳性细胞及 Smac/DIABLO、XIAP、BAD、14-3-3、caspase-9 和 caspase-3 蛋白的上述变化。以上结果提示,癫痫发作可诱导 Smac/DIABLO 蛋白从线粒体向细胞浆的移位、XIAP 亚细胞分布改变和 caspase-9 和 caspase-3 的激活,BAD 和 14-3-3的分离,Smac/DIABLO、XIAP、BAD、14-3-3、caspase-9 和 caspase-3 可能参与了癫痫发作致神经元损伤的病理生理机制, XIAP 和 caspase-9 可能是潜在的保护神经元损伤的治疗靶点。 第三部分 融合蛋白 PTD-XIAP (BIR3-RING) 对癫痫发作致脑 损伤的保护作用 采用脑立体定位注射技术,以深部电极持续记录脑电和激光多普勒血流测定仪记录 r-CBF,建立杏仁核注射 KA 诱导的大鼠边缘叶发作模型,发作 1h 后静脉注射 30mg/kg 安定终止发作。实验动物分 4 组,(1)正常对照组;(2)发作组;(3)PTD-XIAP+KA 组,杏仁核内注射 KA 前 1h 腹腔注射 5mg/kg PTD-XIAP; 2<WP=7>复旦大学博士论文 摘要(4)KA+PTD-XIAP 组,杏仁核内注射 KA 后 1h 腹腔注射 5mg/kg PTD-XIAP。分别用 TUNEL 染色和 cresyl violet 染色观察海马神经元存活和凋亡的变化,westernblot 检测海马 caspase-9 和 casp