目的：支气管哮喘是一种发病率高，严重危害人们身体健康的慢性疾病，其发病的中心环节为气道炎症的形成，多种细胞因子相互作用并形成网络在慢性炎症的发生、发展中起到重要作用，而大多数细胞因子可通过细胞内JAK-STAT途径传递信息，引起靶细胞反应。在哮喘慢性炎症过程中起到重要作用的Th2细胞的分化、IL-4诱导的基因的激活及IgE的产生均是通过来信号转导和转录激活因子6(STAT6)实现的。由变应原诱导STAT6的持续活化、过度表达，可促进Th2细胞的募集、增殖和优势表达IL-4、IL-13等细胞因子，抑制了IL-12等Th1型细胞的功能及其细胞因子，使Th1/Th2比例失衡。STAT6可促使T细胞向Th2细胞分化，同时在IgE的产生及IL-4信号转导中起着至关重要的作用，是变态反应性哮喘病理生理过程中重要的转录因子，目前已成为哮喘基因治疗的新靶点。糖皮质激素(GC)作为目前防治哮喘最有效的药物，不仅可以抑制气道的炎症反应，还能通过减少促炎因子的释放，部分抑制气道胶原纤维沉积，影响气道重塑。目前关于STAT6在气道上皮细胞及T细胞作用文献较多，但有关STAT6在成纤维细胞表达以及STAT6与气道重塑报道较少。试图通过克隆STAT6基因、转染成纤维细胞，以探讨STAT6转录因子对成纤维细胞增殖的影响，以及激素对STAT6核移位及STAT6转染成纤维细胞增殖的影响，以阐明STAT6在气道重塑中的作用机制。绿色荧光报告基因标记系统是一种新的基因及蛋白检测方法，在研究基因表达调控中具有一定运用前景。绿色荧光蛋白(GFP)是一种新的标记基因，对细胞无毒性，不影响与其连接的目的基因的表达，也不影响目的蛋白的结构和功能。在组织和细胞中，能耐受各种处理而保持其发光特性。选择了GFP作报告基因，主要通过酶切位点和阅读框的分析选择了pEGFP-C1载体。通过构建携带STAT6及绿色荧光报告基因的融合蛋白真核表达质粒并检测其在成纤维细胞中的表达，以寻找一种研究STAT6的新方法，同时研究IL-4、BUD对重组质粒转染后的成纤维细胞的影响。 方法： 第一部分：采用PCR技术，从cDNA文库中钓取并扩增STAT6基因全长作为目的基因，经限制性内切酶EcoRⅠ、KpnⅠ双酶切后，酶切产物胶回收，通过PCR产物的粘端克隆法，用T4连接酶将酶切后的STAT6定向克隆入相同限制性内切酶双酶切处理的pEGFP-C1载体的多克隆位点，构建pEGFP-C1-STAT6重组质粒，转化感受态细菌。重组质粒经酶切电泳检测、PCR阳性克隆鉴定及序列分析。 第二部分：利用GenePORTER 2 Transfection试剂盒，将构建好的pEGFP-C1-STAT6重组质粒转染入体外培养的成纤维细胞，24小时后激光共聚焦显微镜检测pEGFP-C1-STAT6融合蛋白在成纤维细胞中的表达。转染后培养的成纤维细胞分四组，对照组、仅IL-4刺激组、BUD干预组、BUD预处理组，分别加入IL-4、IL-4+BUD，刺激前及刺激后(0min,30min,60min)分别用激光共聚焦显微镜观察。IL-4、BUD处理后，转染STAT6的成纤维细胞用免疫组化染色的方法，观察细胞增殖情况。图像采用美国Media Cybernetics公司Image-Pro Plus图像分析软件(Version 4.5)，连续取10个放大倍数为200倍的视野，对片中免疫组化染色的阳性表达进行定量分析，计算每视野阳性染色的积分光密度(integral optical density，IOD)值，取10个视野IOD值的均值为各组最终数据。实验数据结果用SPSS12.0软件作统计学处理，进行单因素方差分析(ANOVA)和多个样本均数之间的多重比较(SNK q法)，以P<0.05表示差异有统计学意义。 结果： 1、用EcoR I、Kpn I双酶切pEGFP-C1真核荧光表达载体和STAT6的PCR产物，分别可得到4.7kb的线性片段和2544bp的DNA片段，大小均与预期结果一致。PCR鉴定重组质粒pEGFP-C1-STAT6，通过PCR产物电泳，结果显示第8、13泳道重组质粒pEGFP-C1-STAT6有特异性扩增产物，与阳性对照组一致，其长度约为802bp，空载体pEGFP的PCR结果为阴性。重组质粒经酶切、PCR及测序证实目的基因STAT6正确连接至pEGFP-C1的多克隆位点，质粒构建成功。 2、pEGFP-C1-STAT6重组质粒转染成纤维细胞后，激光共聚焦显微镜检测到绿色荧光，荧光主要位于胞浆内，细胞核内有少许表达。通过激光共聚焦显微镜可以观察到IL-4刺激组核移位明显，STAT6转录因子大量聚集在细胞核内，在30、60分钟细胞核因STAT6明显增亮。BUD干预组STAT6转录因子在30、60分钟细胞核内仍有聚集，细胞核增亮。而BUD预处理组，用IL-4刺激后，30、60分钟细胞核中STAT6荧光强度与IL-4刺激组无显著差异。经免疫组化染色后，荧光显微镜观察到IL-4刺激组成纤维细胞增殖明显，胞浆中BrdU强阳性表达，与BUD干预组和BUD预处理组相比差异有统计学意义(P=0.001，<0.05)。BUD干预组和BUD预处理组成纤维细胞增殖不明显，BrdU有表达。但BUD干预组和BUD预处理组比较，两者差异无统计学意义(P=0.453，>0.05)。 结论： 1、成功克隆了STAT6基因，并构建了携带STAT6及绿色荧光报告基因的融合蛋白真核表达质粒，经酶切及测序检测结果可靠。 2、成功转染pEGFP-C1-STAT6重组质粒，并在成纤维细胞中获得表达，为STAT6基因的深入研究提供了新技术方法及理论依据。 3、IL-4能够诱导STAT6核移位，BUD不能有效抑制IL-4诱导的STAT6核移位，但能抑制IL-4诱导的细胞增殖，表明抑制细胞增殖并不完全依赖STAT6途径。