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金属-p-内酰胺酶(Metallo-β-lactamases, MβLs)是使细菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药性的靶酶,它们催化水解β-内酰胺类抗生素中的p-内酰胺环,使p-内酰胺类抗生素失去药物活性。由于其水解底物种类分布广泛,目前还没有一种有效的抑制剂。因此,人们对金属-p-内酰胺酶的研究给予了广泛关注。金属-p-内酰胺酶分为B1,B2和B3三个亚组。通过研究,目前对B1和B3类金属-p-内酰胺酶的结构和机理有了一定的了解,但对B2亚组金属-p-内酰胺酶的研究较少。为了进一步了解B2亚组金属-p-内酰胺酶,本实验在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了金属-β-内酰胺酶ImiS,通过FPLC对蛋白进行纯化,产率为5mg/L,经过MALDI-TOF MS测定,确定ImiS的分子量为25234.49。制备得到去金属的apo-ImiS蛋白,并对ImiS和apo-ImiS进行了金属含量分析,荧光光谱表征,圆二色谱表征,Zeta-电位以及有效粒径的测量。为了进一步探索金属-β-内酰胺酶ImiS催化碳青霉烯类抗生素的水解机理,对ImiS催化水解亚胺培南(Imipenem)反应过程进行了热动力学研究。实验测得该水解反应在293.15,298.15,303.15和308.15K温度条件下,其反应自由能ΔG≠θ分别为86.40,87.54,88.77和89.84kJ·mol-1,速率常数k分别为2.4558,2.8549,3.1917和3.7789x10-3s-1,反应活化焓ΔH≠θ为18.59kJ·mol-1,反应活化熵ΔS≠θ为-231.34J·mol-1·K-1,表观活化能E为21.0843kJ·mol-1,该反应为1.5级反应。为了进一步了解金属离子在金属-β-内酰胺酶ImiS中的作用,对金属重组apo-ImiS过程进行了热动力学研究。研究结果显示,在298.15K条件下,Zn(Ⅱ)和Co(Ⅱ)与apo-ImiS结合时反应自由能ΔG≠θ分别为92.948和93.908kJ·mol-1。金属-p-内酰胺酶ImiS催化Imipenem的水解产物,对水解反应有一定的抑制作用。为了进一步深入研究底物抑制现象,本实验通过ImiS水解Imipenem得到水解产物,使用HPLC对其进行分离纯化,通过LC-MS测得其分子量为316.0827。通过紫外光谱和荧光光谱对水解反应过程进行检测,结果表明该水解产物与Imipenem有明显的差异。对水解产物的抑菌活性分别进行了MIC和抑制常数Ki值的测量,结果显示,水解产物对耐药菌ESBL E.coli, MRSA1, MRSA2, CcrA, ImiS和L1都有一定的抑菌效果,对CcrA, ImiS和L1催化抗生素水解反应的抑制常数Ki值分别为118.2,41.56和49.87μM,抑制类型均为非竞争性抑制。这一研究所获得的信息,将为研究和发展新型金属-p-内酰胺酶的抑制剂开辟新的途径。